Zur Erfassung trans-wirksamer Komponenten der Sauerstoff-abhängigen Gärungsregulation der Hefe Pichia stipitis

Schruff, Barbara Susanne; Klinner, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-11339

Zur Erfassung trans-wirksamer Komponenten der Sauerstoff-abhängigen Gärungsregulation der Hefe Pichia stipitis

Schruff, Barbara Susanne (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Barbara Susanne Schruff

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang153 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Klinner, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-02-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-11339
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-121699
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59963/files/59963.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pichia stipitis (Genormte SW) ; Gärung (Genormte SW) ; Genregulation (Genormte SW) ; Sauerstoff (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Pichia stipitis (frei) ; Sauerstoff-abhängige Transkriptionsregulation (frei) ; HIF1 alpha (frei) ; Transformationseffizienz (frei) ; ends-out Kassette (frei) ; Reportergen (frei) ; 5-FAA (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Zur Konstruktion eines Stamms zur Isolation regulatorischer PsADH2-Mutanten wurde ein Reportergen unter die Kontrolle des PsADH2-Promotors gebracht. Nach Mutagenese des Stamms wurde eine potentielle PsADH2-Regulationsmutante isoliert. Der Transformationswirt zeigte in gut-kontrollierten Batch-Fermentationen ein vom Wildtyp-stamm abweichendes Gärungsverhalten. Unter aeroben Bedingungen wurden eine vergleichs-weise hohe ADH-Aktivität, nach Shift der O2-Spannung zu 20 % eine verzögerte ADH-Induk-tion und unter anaeroben Bedingungen stark abgeschwächte ADH- und PDC-Aktivitäten gemes-sen. Unter anaeroben Bedingungen wurde ein Pasteur-Effekt beobachtet, der beim Transfor-mationsstamm jedoch weniger stark ausgeprägt war als beim Wildtyp. Das PsHIS3-Gen wurde sequenziert und durch Southern-Hybridisierung als „single copy“-Gen identifiziert. Die Eignung von PsURA3 und ScTRP5 als Reportergene wurde untersucht. Die Selektion von Ura3- und Trp5-auxotrophen Mutanten auf 5-FOA- bzw. 5-FAA-haltigen Medien war möglich. Da das Einführen der Ura3-Auxotrophie in den Transformationsstamm P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 weder durch Disruption des Gens noch durch Kreuzung mit Ura3-auxotrophen Stämmen gelang, wurde ScTRP5 als Reportergen unter die Kontrolle des PsADH2-Promotors gebracht. Zur Integration der Reporterkassette wurden verschiedene Vektortypen konstruiert und ihre transformierenden Eigenschaften untersucht. Generell konnte die Transformationseffizienz in P. stipitis verbessert werden, indem lineare DNA mit blunt-ends transformiert wurde oder durch die Kotransformation von der zu integrierenden DNA und doppelsträngiger DNA mit komple-mentären sticky-ends. Die Transformation zirkulärer, nicht replizierender Vektoren oder von ends-out-Kassetten mit sticky-ends führte nicht zu Transformanten. Zur stabilen Integration der Reporterkassette wurde ein ends-out-Vektor verwendet, der in pUC19-Sequenzen mit blunt-ends eingebettet war und ähnlich hohe Transformantenraten wie autonome Vektoren erzielte. Southern-Hybridisierungen zeigten, dass die Reporterkassette vorwiegend ektopisch integrierte. Durch einen Plasmidverlust-Test des autonomen Reporterplasmids konnte nachgewiesen werden, dass ScTRP5 unter der Kontrolle des PsADH2-Promotors exprimiert wird. Bei ektopischer Integration der Reporterkassette oder beim Vorliegen eines autonomen Vektors in der Zelle entstand mittels PCR ein Amplifikat, das nur bei homologer Kassetten- integration erwartet wurde. Die Verwendung von PCR als einziger Nachweismethode homologer Vektorintegration kann daher zur Fehlinterpretation von Transformationsdaten führen. Die Induktion einer Trp-Auxotrophie war im Reporterstamm mittels UV-Mutagenese, jedoch nicht durch REMI verschiedener Vektoren möglich. Entgegen den Erwartungen konnten Transformanten mit integrierter Reporterkassette auch unter aeroben Bedingungen selektiert werden. Für die Selektion regulatorischer ADH2-Mutanten bedeutet dies, dass konstitutive Regulationsmutanten nicht vom nicht-mutagenisierten Ausgangsstamm unterschieden werden können. Die Selektion nicht-aktivierbarer Mutanten ist jedoch möglich.

To construct a strain for the isolation of regulatory PsADH2-mutants a reporter gene was brought under the control of the PsADH2-promotor. Following the mutagenesis of the strain, a potential PsADH2-mutant was isolated. The transformation recipient showed in well-controlled batch fermentations a behavior, which differed from the wild type strain. Under aerobic conditions a comparably high ADH activity was measured. After shifting the O2-tension to 20 % a slowed ADH induction, and under anaerobic conditions a strongly weakened ADH- and PDC-activity was measured. Under anaerobic conditions a Pasteur effect was seen, which was less pronounced in the transformation strain than in the wild type. The PsHIS3-gene was sequenced and via southern hybridization identified as a single-copy gene. The suitability of PsURA3 and ScTRP5 as reporter genes was investigated. In P. stipitis the selection of Ura3- and Trp5-auxotrophic mutants on media containing 5-FOA respecttively 5-FAA was possible. As the introduction of the Ura3-auxotrophy into the transformation strain P. stipitis PJH53 his3-1 trp5-10 did not prove possible, neither by disruption of the gene, nor by crossing Ura3-auxotrophic strains, ScTRP5 was brought under the control of the PsADH2-promotor as a reporter gene. To integrate the reporter cassette into the transformation recipient, various vector types were constructed and their transformational properties were investigated. In general, the transformation efficiency of P. stipitis could be improved by transforming linear DNA with blunt-ends, or by co-transformation of the DNA to be integrated and double-strand DNA with complementary sticky-ends. The transformation of circular, non-replicating vectors or of ends-out cassettes with sticky-ends did not lead to transformants. To achieve a stable integration of the reporter cassette, an ends-out vector was used, which was embedded into pUC19 sequences with blunt ends and which yielded similarly high transformation rates as autonomous vectors. Southern-hybridizations demonstrated that the reporter cassette integrated mainly ectopic. Through a plasmid loss test of the autonomous reporter plasmid, it was established, that ScTRP5 is expressed under the control of the PsADH2-promotor. In case of an ectopic integration of the reporter cassette or in case of the occurence of an autonomous vector in the cell the creation of an amplificate through PCR, which was only expected with homologous cassette integration, was possible. The use of PCR as the single detection method for homologous vector integration can lead to misinterpretation of transformation data. The induction of a Trp-auxotrophy was possible in the reporter strain by the use of UV-mutagenesis but not by the use of REMI of various vectors. Contrary to expectations, the selection of transformants with integrated reporter cassette proved possible even under aerobic conditions. For the selection of regulatory ADH2-mutants, this means that constitutive regulation mutants cannot be distinguished from the non-mutated original strain. However, the selection of non-activating mutants is possible.

OpenAccess:
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