Leber-Fibrose: Erstellung eines Modells zur Analyse lebertoxischer Substanzen und Analyse der ltbp1-abhängigen Aktivierung hepatischer Sternzellen

Knöbel, Sebastian Mathias; Weiskirchen, Ralf

doi:HT014952140

Leber-Fibrose: Erstellung eines Modells zur Analyse lebertoxischer Substanzen und Analyse der ltbp1-abhängigen Aktivierung hepatischer Sternzellen = Liver fibrosis : generation of a model for the analysis of liver toxic substances and analysis of the ltbp1-dependent activation of hepatic stellate cells

Knöbel, Sebastian Mathias (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sebastian Mathias Knöbel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangV, 132 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weiskirchen, Ralf (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-11-30

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-17505
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/60042/files/Knoebel_Sebastian.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Klinische Chemie und Pathobiochemie (526000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Leber (Genormte SW) ; Leberkrankheit (Genormte SW) ; Leberperfusion (Genormte SW) ; Leberepithelzelle (Genormte SW) ; Differenzierung (Genormte SW) ; Embryonale Stammzelle (Genormte SW) ; Ito-Zelle (Genormte SW) ; Fibrose (Genormte SW) ; Toxizität (Genormte SW) ; Kollagen (Genormte SW) ; FACS (Genormte SW) ; Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer (Genormte SW) ; Zellfraktionierung (Genormte SW) ; Grün fluoreszierendes Protein (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; MACS (frei) ; in vitro Differenzierung (frei) ; hepatische Sternzelle (frei) ; Hepatozyt (frei) ; ltbp1 (frei) ; embryonic stem cell (frei) ; in vitro differentiation (frei) ; hepatocyte (frei) ; hepatic stellate cell (frei) ; liver fibrosis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Leber ist das zentrale Organ des Stoffwechsels und gleichzeitig die größte Drüse des Säugetierorganismus. Ein Ausfall der Leberfunktion nach chronischer Schädigung, beispielsweise durch Infektionen oder toxische Substanzen, hat allerdings drastische Konsequenzen für den Organismus. Daher fällt der Erforschung der Ursachen und Pathogenese von Lebererkrankungen eine wichtige Rolle zu. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Projekte aus dem Themenkomplex Leber-Fibrose bearbeitet. Im ersten Teil der Arbeit wurde versucht, einen transgenen Oberflächenmarker (EGFP) hepatozytenspezifisch zu exprimieren, um damit aus in-vitro-differenzierten ES-Zellen spezifisch hepatische Vorläuferzellen zu isolieren und diese für in-vitro-Toxizitäts-Assays einsetzen zu können. Nach der Validierung der angestrebten Isolierungsmethode (MACS), wurde ein Reporterkonstrukt zur albumin-Promotor-getriebenen Oberflächen- und Selektionsmarker-Expression kloniert und hinsichtlich der Expressionsspezifität in vitro und in vivo untersucht. In der murinen Hepatomzelllinie HEPA-1-6 konnte die Funktionalität des Konstruktes nachgewiesen werden. In verschiedenen ES- Zellklonen führte das Konstrukt jedoch zu unspezifischer Basalexpression und lieferte auch nach Differenzierung der ES-Zellen zu hepatozytenartigen Zellen keine nennenswerten Mengen an EGFP-Protein. In einem durch Oozyteninjektion generierten Mausmodell führte das Konstrukt ebenfalls zur Expression nur geringster Mengen an EGFP in der Leber. Ein parallel verfolgter knock-in-Ansatz zur gerichteten Integration des Selektionsmarkers in das ES-Zell-Genom unter Kontrolle des natürlichen albumin-Locus lieferte keine positiven Klone. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des latent transforming growth factor beta binding protein 1 (LTBP1) auf die Aktivierung bzw. Transdifferenzierung hepatischer Sternzellen (HSC) in vitro und in vivo untersucht, einem für die Pathogenese der Leber-Fibrose entscheidendem Prozess. Als Grundlage diente eine ltbp1-defiziente Maus, bei der beide bekannten Protein-Isoformen LTBP1-L und LTBP1-S fehlen. Die nähere Charakterisierung führte zur Identifikation einer neuen Spleissvariante der ltbp1-mRNA, die in analoger Form bei Mensch und Ratte vorkommt. Durch Microarray-Analysen konnte eine verringerte Tendenz zur in-vitro-Transdifferenzierung ltbp1-defizienter HSC nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden - neben bekannten Markergenen für aktivierte HSC – weitere, noch nicht beschriebene Markergene identifiziert. Anschließende in-vivo-Studien in einem experimentellen Modell zur Induktion der Leber-Fibrose bestätigten die aus der in-vitro-Studie abgeleitete Hypothese einer verminderten Transdifferenzierungsneigung von ltpb1-defizienten HSC in fibrosierenden Lebererkrankungen, die sich in einer verminderten Kollagendeponierung durch HSC im Leberparenchym der knock-out-Tiere äußerte. Die Studie gewährt somit Einblick in die Rolle des LTBP1 während der Pathogenese der Leber-Fibrose und betont seine klinische Relevanz, die durch weitere Analysen zu bestätigen sein wird.

The liver is the central organ of metabolism and at the same time constitutes the biggest gland of the mammalian organism. Breakdown of liver function after chronic damage caused by viral infection or toxic substances implicates severe consequences for the organism. Research on the causes and the pathogenesis of liver diseases therefore is of major importance. This work adresses two questions in relation to liver fibrosis. The first part of this work deals with the expression of EGFP as a transgenic hepatocyte specific surface marker, by means of which hepatic precursors can be isolated from in vitro differentiated murine embryonic stem cells to generate functional cells for toxicological screenings. After validation of the isolation method (MACS), a reporter construct with an albumin promotor driven expression of the surface-/selection-marker was cloned and the expression specificity was analysed in vitro and in vivo. The functional expression of the transgene and its correct subcellular localization was confirmed using the hepatoma cell line HEPA-1-6. However, transfected ES cells showed basal, albumin independent expression of the transgene and even after in vitro differentiation into hepatocyte like cells did not express sufficient amounts of EGFP protein. Analysis of a transgenic mouse model generated by oocyte injection with the same reporter construct revealed that even under in vivo conditions only marginal amounts of EGFP were produced in the liver. Using a targeting strategy which aimed to knock in the EGFP-selection marker into the mouse albumin locus did not lead to the identification of positive ES cell clones. In the second part of this work, the influence of the latent transforming growth factor beta binding protein 1 (LTBP1) on the „activation“ of hepatic stellate cells (HSC) was analysed. Following „activation“ HSC transdifferentiate towards a myofibroblastic phenotype and constitute the most important fibrogenic cell type during the pathogenesis of liver fibrosis. Using a ltbp1-deficient mouse model in which both known protein isoforms LTBP1-L and LTBP1-S are missing, revealed a new ltbp1 splice variant of which analogous isoforms also exist in rats and humans. Microarray analysis was used to identify known and so far unknown marker genes for activated HSC and more importantly demonstrated that ltbp1-deficient HSC have a reduced tendency to transdifferentiate in vitro. This observation was independently confirmed in vivo using an experimental model for the induction of liver fibrosis (ligation of the common bile duct). After 4 weeks of bile duct obstruction, ltbp1-/- mice showed markedly reduced signs of liver fibrosis, i.e. less Collagen I deposition by HSC in the affected liver parenchyma. The study therefore provides insight into the role of LTBP1 during the pathogenesis of liver fibrosis and points out the clinical relevance of LTBP1, which needs to be confirmed by subsequent analysis.

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