Kupplung der DNA-Methyltransferase M.SssI mit Triplehelix-bildenden Oligodesoxynucleotiden

Monami, Amélie Joséphine; Weinhold, Elmar

doi:HT015025321

Kupplung der DNA-Methyltransferase M.SssI mit Triplehelix-bildenden Oligodesoxynucleotiden = Coupling of the DNA methyltransferase M.SssI with triple helix forming oligodeoxynucleotides

Monami, Amélie Joséphine (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Amélie Joséphine Monami

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangXII, 159 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-01-15

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-18126
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61772/files/Monami_Amelie.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chemie (frei) ; DNS-Methyltransferase (frei) ; M.SssI (frei) ; Triplehelix (frei) ; Oligodesoxynucleotid (frei) ; triple helix (frei) ; oligodeoxynucleotide (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
DNA-modifizierende Enzyme, wie DNA-Methyltransferasen (DNA-MTasen) und Restriktionsendonucleasen (REasen), könnten genutzt werden, um Genome abzubilden oder zu manipulieren. Dazu sind diese Enzyme aufgrund ihrer allgemein kurzen Erkennungssequenzen jedoch nicht geeignet und eine Erhöhung ihrer Sequenzspezifität wäre wünschenswert. Eine Strategie zur Entwicklung von megaspezifischen DNA-modifizierenden Enzymen ist die Kupplung des Enzyms mit Triplehelix-bildenden Oligodesoxynucleotiden (TFO). Diese zusätzlichen DNA-erkennenden Einheiten sollten die Enzyme nur zu bestimmten DNA-Erkennungssequenzen adressieren und damit zu einer Erhöhung der Sequenzspezifität führen. In dieser Arbeit wurde die DNA-Cytosin-C5-MTase M.SssI aus Spiroplasma sp. Stamm MQ1 mit TFO gekuppelt. M.SssI ist die einzige, bekannte prokaryotische DNA-Cytosin-C5-MTase, die wie die menschlichen DNA-MTasen Cytosin innerhalb der Erkennungssequenz 5' CG-3' methyliert. Eine so hergestellte, megaspezifische M.SssI könnte dann genutzt werden, um Gene durch gene silencing spezifisch auszuschalten. Dabei stellt das EpCAM-Gen, das bei einer Vielfalt von Karzinomen überexprimiert wird und an der Karzinogenese teilnimmt, ein interessantes Ziel. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde M.SssI mit TFO durch Native Chemical Peptide Ligation (NCPL), Thiazolidin-Ligation, Expressed Protein Ligation (EPL) und heterobifunktionelles Crosslinking gekuppelt und die verschiedenen Methoden optimiert und miteinander verglichen. Außerdem wurde die Variante M.SssI-C141S, die kein katalytisches Cysteinrest besitzt, aber eine restliche DNA-Methyltransferaseaktivität von circa 0,3% aufweist, mit einem für das EpCAM-Promoter entwickelten TFO durch heterobifunktionelles Crosslinking gekuppelt. Das so gebildete M.SssI-TFO-Konjugat wurde durch Anionenaustauscher-Chromatographie in einem Reinheitsgrad von über 95% isoliert. Im zweiten Teil dieser Arbeit demonstrierte die Gruppe von Dr. P. McLaughlin die Profektion von M.SssI in den Zellnucleus mit einem kationischen Komplex aus N-Methyl-4-(dioleoyl)methyl-pyridinium-chlorid (SAINT-2) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE).

DNA modifying enzymes, like DNA methyltransferases (DNA MTases) and restriction endonucleases (REases), could in principle be used to map or manipulate genomes. However, these enzymes are inappropriate for that purpose because of their generally short recognition sequences. An increase of their sequence specificity would therefore be desirable. One strategy to produce megaspecific DNA modifying enzymes is to couple them with triple helix forming oligodeoxynucleotide (TFO). These additional DNA recognition units should address the enzymes only to predetermined DNA recognition sequences and result in an increase in their sequence specificity. In this research, the DNA cytosin-C5-MTase M.SssI from Spiroplasma sp. strain MQ1 was coupled with TFO. M.SssI is the only known prokaryotic DNA cytosin-C5-MTase, which methylates cytosin within the recognition sequence 5' CG-3' like mammalian DNA-MTases. Such a megaspecific M.SssI could then be used to silence specific genes. The fact that the EpCAM gene is overexpressed in a variety of carcinome and is involved in carcinogenesis makes it an interesting target. In the first phase of this research, M.SssI was coupled with TFO by native chemical peptide ligation (NCPL), thiazolidine ligation, expressed protein ligation (EPL) and heterobifunctional crosslinking. The different methods were optimised and compared with one another. Furthermore, the variant M.SssI-C141S, which doesn’t possess a catalytic cysteine residue but still shows a residual DNA MTase activity of approximately 0,3%, was coupled with a TFO, which was specifically designed for the EpCAM promotor. The produced M.SssI-TFO conjugate was purified to more than 95% by anion exchange chromatography. In a second phase, the group of Dr. P. McLaughlin demonstrated the profection of M.SssI in the cell nucleus with a cationic complex formed of N-Methyl-4-(dioleoyl)methyl-pyridinium-chlorid (SAINT-2) and 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) .

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