Entwicklung und Untersuchung eines Verfahrens zur integrierten Aufreinigung von Plasmid DNA mittels wässriger Zweiphasenextraktion

Frerix, Andreas; Wandrey, Christian

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-16240

Entwicklung und Untersuchung eines Verfahrens zur integrierten Aufreinigung von Plasmid DNA mittels wässriger Zweiphasenextraktion = Development and investigation of an integrated purification process of plasmid DNA using aqueous two-phase extraction

Frerix, Andreas (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Andreas Freirix

ImpressumJülich : Forschungszentrum, Zentralbibliothek 2006

UmfangVII, 127 S. : Ill., graph. Darst.

ISBN978-3-89336-442-8

ReiheSchriften des Forschungszentrums Jülich : Lebenswissenschaften ; 29

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wandrey, Christian (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-04-06

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16240
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61851/files/Frerix_Andreas.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ingenieurwissenschaften (frei) ; Plasmid (frei) ; DNS (frei) ; Extraktion (frei) ; Aufreinigung (frei) ; Produktaufarbeitung (frei) ; wässriges Zweiphasensystem (frei) ; supercoiled (frei) ; ATPS (frei) ; downstream processing (frei) ; DNA (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Plasmide sind doppelsträngige und zirkuläre DNA Moleküle, die vor allem als Vektor zur Übertragung von Genen bekannt sind. Aus diesem Grund haben sie eine große Bedeutung in der Molekularbiologie bzw. in der Gentechnik. Zur Zeit gibt es ein großes Interesse, diese Eigenschaft der Plasmide auch zur Übertragung von therapeutischen Genen im Rahmen der Gentherapie und zur DNA Vakzinierung einzusetzen. Die Herstellung der Plasmid DNA erfolgt biotechnologisch durch Kultivierung optimierter E. coli Stämme. Die daran anschließende Aufreinigung der Plasmid DNA ist vergleichsweise aufwendig, weshalb hierfür ein Bedarf an neuen Verfahren besteht. Der in dieser Arbeit generierte Prozeß besteht aus drei Verfahrensschritten. Er beginnt mit einem alkalischen Aufschluß der Bakterienzellen und einer ersten Abtrennung grober Verunreinigungen durch eine Zweiphasenextraktion. Hierzu wurde ein System bestehend aus 15% PEG 800 und 20% Kaliumphosphat eingesetzt. Dabei wurden Bedingungen gefunden, die zu einer Extraktion von etwa 90% der Plasmide in die Unterphase führen, während der Großteil der Kontaminanten zusammen mit Feststoffen (Zellpräzipitate) in die Oberphase abgetrennt werden. Verteilungsexperimente mit Plasmid DNA und RNA, die in Abhängigkeit von der Temperatur, pH Wert und vom PEG- Molekulargewicht durchgeführt wurden, zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen den gewählten Bedingungen und der Verteilung der Plasmid DNA. Dies konnte auf die Löslichkeit der Plasmid DNA in der Oberphase zurückgeführt werden, die sich durch Veränderung vom PEG Molekulargewicht bzw. von der Temperatur drastisch verändert. Zudem wurde die Vermutung aufgestellt, dass diese Löslichkeitsänderung im Zusammenhang mit einer Strukturänderung der DNA steht, die als Coil-Globule Transition bekannt ist. Zur Isolierung der Plasmid DNA aus der Unterphase nach der Grobreinigung wurde eine Methode entwickelt, die die hohe Kaliumphosphatkonzentration in der Unterphase (ca. 30% w/w) ausnutzt. Dabei wurde die Plasmid DNA vermutlich durch hydrophobe Interaktion an die Nylonmembran adsorbiert und konnte durch anschließende Filtration von TE-Puffer eluiert werden. Zur gezielten Abreicherung chromosomaler DNA und unerwünschter offen zirkulärer Plasmid DNA wurde ein dritter Verfahrensschritt entwickelt. Dieser basiert auf der selektiven Renaturierung von supercoiled Plasmid DNA nach der Einwirkung alkalischer Bedingungen und anschließender Neutralisation. Eine weitere wässrige Zweiphasenextraktion wurde genutzt, um die so denaturierte DNA von der in die Unterphase extrahierte supercoiled Plasmid DNA zu trennen. Durch dieses Verfahren konnte der Anteile offen zirkulärer DNA auf etwa 4-6% und von chromosomaler DNA auf <1% reduziert werden, wobei eine Ausbeute von 90-95% supercoiled Plasmid DNA erreicht wurde. Der vollständige Prozeß zur Aufreinigung von Plasmid DNA besteht aus der Kombination der ersten Extraktion zur Abtrennung grober Verunreinigungen, der Entsalzung durch reversible Membranadsorption und der Feinreinigung zur Abtrennung von chromosomaler DNA und offen zirkulärer Plasmide. Dieser Prozeß wurde zur Verarbeitung von 100 g Biomasse durchgeführt und mit dem auf Chromatographie basierten Verfahren von QIAGEN verglichen. Hierbei konnten vergleichbare Ausbeuten erzielt werden, während der Anteil an supercoiled Plasmid DNA beim Extraktionsverfahren etwas höher war. Hinsichtlich des Anteils an chromosomaler DNA, offen zirkulärer Plasmide und RNA konnten mit dem Extraktionsverfahren die gesetzten Spezifikationen erreicht werden. Eine weitere Maßstabsvergrößerung des Extraktionsprozesses ist zur Zeit aufgrund von Limitierungen der Phasenseparation eingeschränkt. Extraktionsversuche im kleinen Maßstab zeigten darüber hinaus, dass die Kombination aus Extraktion mit der Entsalzung durch Membranadsorption eine interessante Alternative zur Minipräparation von Plasmid DNA bieten kann.

Plasmids are double stranded circular DNA molecules, mainly known as vectors for transferring genes. Therefore, plasmids have a high importance for molecular biology and gene technology respectively. Presently, there is a high interest to utilize plasmids in gene therapy and DNA vaccination due to their ability to replace or supplement genes. The manufacturing of plasmid DNA is performed using biotechnological processes by cultivation of optimized E. coli strains. The developed three-step purification process begins with an alkaline lysis of bacterial cells and separation of crude impurities and cell debris using two phase extraction. In this study, a systematic screening led to an optimal system comprising 15% PEG 800 and 20% potassium phosphate. This system resulted in a plasmid DNA recovery of about 90 % plasmid in the bottom phase, while most of contaminants together with solids (cell precipitate) are separated into the top phase. Partitioning experiments of plasmid DNA and RNA, performed as a function of temperature, pH and PEG molecular weight, showed a close relation between system conditions and partitioning of plasmid DNA. In the investigated two-phase system it was found that changing the temperature from 15 to 20°C leads to a partitioning of plasmid DNA from top to bottom phase. This could be attributed to the plasmid solubility in the top phase, which is drastically affected by variation of PEG molecular weight and temperature respectively. The assumption is, that differences of solubility are associated with a structural change of plasmid DNA, known as coil-globule transition. After separation of the main contaminants (capturing) and extraction of plasmid DNA into the bottom phase, the plasmid DNA is isolated from the bottom phase using an adsorptive membrane step. The high potassium phosphate concentrations in the bottom phase were exploited in order to facilitate hydrophobic interaction for the adsorption of plasmid DNA on a nylon membrane followed by a subsequent elution using TE-buffer. During this desalting and concentration process, a step recovery of 95% plasmid DNA and an 85% reduction of the RNA content could be determined. For a specific depletion of chromosomal DNA and open circular plasmid DNA a third process step was developed, which is based on a sequence comprising denaturation of the nucleic acids present and selective renaturation of supercoiled plasmid DNA followed by selective partitioning in an ATPS. During this procedure, chromosomal and open circular DNA are irreversibly denatured. The drastic change of hydrophobicity enabled the separation from native supercoiled plasmid DNA using the second aqueous two phase system. With this procedure, the fraction of open circular DNA is reduced to 4-6% and of chromosomal DNA to <1% together with a supercoiled DNA yield of 90-95%. The complete process for purification of plasmid DNA is thus a combination of a first extraction for the separation of main impurities (capture), followed by desalting step using reversible membrane adsorption and polish step for the removal of chromosomal DNA and open circular plasmids. Consequently, this procedure was applied for the processing of 100 g biomass and compared to the chromatography based purification method established and commercialized by QIAGEN. As a result, comparable recoveries were achieved, whereas the fraction of supercoiled plasmids was slightly higher for the extraction procedure. Regarding the fraction of chromosomal DNA, open circular plasmids and RNA, the targeted specifications were met. A further scale up of the process seems feasible after solving limitations connected with the mechanical process of phase separation. In addition, extraction in small scale by combining extraction with membrane adsorption shows an interesting alternative for mini-preparation of plasmid DNA.

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