Generierung von Transposonmutanten des Epstein-Barr-Virus zur Charakterisierung von Genfunktionen für die lytische Virusvermehrung und die virale Latenz

Peters, Michele; Kreuzaler, Fritz

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-9689

Generierung von Transposonmutanten des Epstein-Barr-Virus zur Charakterisierung von Genfunktionen für die lytische Virusvermehrung und die virale Latenz

Peters, Michele (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michele Peters

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

Umfang124 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kreuzaler, Fritz (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-10-29

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9689
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62041/files/Peters_Michele.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Epstein-Barr Virus (frei) ; Transposonmutagenese (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Epstein-Barr Virus (EBV) verursacht die infektiöse Mononukleose und ist an der Entstehung von Malignomen wie dem Burkitt-Lymphom und dem Nasopharynxkarzinom beteiligt. Die initialen Schritte der EBV abhängigen Immortalisierung und Tumorentstehung sind noch weitgehend ungeklärt. Die überwiegende Zahl der EBV-Gene und Genprodukte sind funktionell keineswegs vollständig charakterisiert, sie aber dürften der Schlüssel für die Aufklärung der onkoviralen Wirkung sein. Ein erfolgversprechender Ansatz zur Charakterisierung der Funktion EBV kodierter Gene ist die vollständige Mutagenisierung des EBV-Genoms mit nachfolgender Charakterisierung der Mutanten. In dieser Arbeit wird eine Methode zur effizienten Transposonmutagenese des Epstein-Barr Virus vorgestellt. An die Generierung der EBV-Mutanten schloß sich die morphologische und funktionelle Charakterisierung an. Durch homologe Rekombination zwischen mutierten EBV-Subklonen mit Wildtyp-Virionen aus der Zell-Linie B958 wurden EBV-Mutanten mit Insertionsmutationen in den Leserastern BGLF-5 (EBV-DNase) und BDLF-2 generiert und in Raji-Zellen selektiert. Nach der Infektion von B-Lymphozyten EBV-negativer Spender mit EBV-BGLF-5- und EBV-BDLF2- wurde das Expressionsmuster der viralen Gene BZLF-1, BRLF-1, BMRF-1, BHRF1, EBNA-1, -2, -3A-C, LMP-1 und -2 mittels PCR und Immunfluoreszenztest untersucht. Die infizierten Zellen wurden morphologisch und auf eine veränderte Expression der Oberflächenproteinen CD11a, CD23, CD30, CD40, CD44, CD54, CD58 analysiert. Als Kontrollen dienten Wildtyp-EBV infizierte Zellen und nicht infizierte Zellen. Beide Mutanten exprimierten kurzzeitig einige der untersuchten viralen Gene, zeigten jedoch keine vermehrte Expression von Oberflächenproteinen. Die BLymphozyten wurden von Mutanten-Virionen nicht immortalisiert. Das Wildtyp-EBV hingegen unterstützt die vermehrte Expression von Oberflächenproteinen und führt zur Immortalisierung der Zellen. Es konnte gezeigt werden, daß die Expression der EBV-kodierenden Gene BGLF-5 und BDLF2 den lytischen Zyklus, die Etablierung eines Latenzstadiums und die Immortalisierung von B-Lymphozyten beeinflußt. Ein in diesen Genen mutiertes EBV erfüllt die Voraussetzungen für einen Lebendimpfstoff; beide Mutanten weisen einen selbstlimitierenden lytischen Zyklus auf und exprimieren immundominante virale Produkte. Ihnen fehlt die Fähigkeit zur Etablierung einer Latenz und Immortalisierung.

The Epstein-Barr virus (EBV) causes infectious mononucleosis and is associated with malignancies like Burkitt’s lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. So far, the initial steps of tumor development and the role of the virus in this process have not yet become clear. The key for elucidation of the oncopathogenic effect may lie in the identification of viral genes because the functions of most EBV-encoded genes and gene products are not yet known. To approach this problems, the EBV genome has to be mutated and the mutants have to be characterized. In this work, a method for efficient transposon-mutagenesis of the EBV is presented. EBV mutants have been generated and characterized morphologically and functionally. Mutants with insertion mutations in the open reading frames BGLF-5 (EBV DNase) and BDLF-2 were generated by homologous recombination between mutated EBV subclones and wildtype virus from the cell line B95-8 and subsequently selected in Raji cells. B-lymphocytes from EBV negative donors were infected with the EBV-BGLF-5- and EBV-BGLF-2- mutants, viral gene expression was investigated by PCR (BZLF-1, BRLF-1, BMRF-1, BHRF-1, EBNA-1, -2, -3A-C, LMP1, -2) and immuno fluorescence assay (EA-D, LMP-1). The cells were analyzed morphologically and with regard to a modulated expression of surface markers (CD11a, CD23, CD30, CD40, CD44, CD54, CD58). Wildtype EBV infected cells and uninfected cells were used as controls. Both mutants expressed a subset of the investigated genes for a short period. An increased surface marker expression could not be detected and the cells did not become immortalized. In wildtype virus infected B-cells in contrast, all genes were expressed during the observation period. The expression of surface markers was increased and the cells became immortalized. This led to the conclusion that the expression of BGLF-5 and BDLF?2 influences the lytic cycle, the establishment of latency and immortalization of B-lymphocytes. Thus, both mutants express viral products that cause an immune response, but do not have the potential to immortalize the cells or to establish latency. This makes them candidates for an EBV live vaccine.

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