Directed evolution of Arabidopsis thaliana carotenoid cleavage dioxygenase 1

Behrendt, Dominik; Schwaneberg, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-40508

Directed evolution of Arabidopsis thaliana carotenoid cleavage dioxygenase 1 = Gelenkte Evolution von Arabidopsis thaliana Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1

Behrendt, Dominik

2011 & 2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dominik Behrendt

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangIII, 61 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Prüfungsjahr: 2011. - Publikationsjahr: 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-11-18

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-40508
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62850/files/4050.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymtechnologie (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Karotenoid Spaltung (frei) ; gelenke Evolution (frei) ; AtCCD1 (frei) ; Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1 (frei) ; CCD1 (frei) ; directed evolution (frei) ; carotenoid cleavage dioxygenase 1 (frei) ; organic cosolvents (frei) ; carotenoid cleavage (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
rvk: WF9780 * WF 9730

Kurzfassung
Arabidopsis thaliana Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1 (AtCCD1) ist das Modell-Enzym für CCDs, eine Enzymklasse die spezifisch C=C Doppelbindungen in Karotinoiden und Apo-Karotinoiden spalten. CCD1er spalten Karotinoide symmetrisch und regioselektiv an der 9-10 sowie 9‘-10‘ Doppelbindung. Das aktive Zentrum von CCDs besteht aus einem, häm-freien Fe2+ das durch 4 Histidine koordiniert wird. Die enzymatische Spaltung benötigt ausschließlich molekularen Sauerstoff und keine weiteren - Cofaktoren. Auf dieser einmaligen enzymatischen Spaltung basiert eine Vielzahl von Farb-, Geruchs- und Geschmackstoffen. Die Spaltung kommt in allen Bereichen des Lebens vor, von Einzellern über Mehrzellern zu Archae und Pflanzen. In vitro kann die CCD1 Spaltung durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln beschleunigt werden, jedoch ist der verantwortliche Effekt bisher ungeklärt. Die Mehrzahl der karotinoiden Spaltprodukte weißt eine komplexe chemische Struktur auf und kann nicht chemisch synthetisiert werden. Die Nutzung der enzymatisschen Spaltung von Karotinoiden zur Synthese dieser Naturstoffe ist ein neuer und vielversprechender Ansatz. Die rekombinante Expression von AtCCD1 erfolgt hauptsächlich als „inclusion bodies“ und es wird nur eine geringe enzymatische Aktivität erzielt. AtCCD1 kann aus den „inclusion bodies“ rückgefaltet werden, oder mittels N- oder C-terminalen Tags aufgereinigt werden. Beide Methoden führen zu einem modifizierten, nicht-nativen Enzym, das nur bedingt zur Charakterisierung von CCDs verwendet werden kann. Ein Tag-freies Aufreinigungsverfahren wurde entwickelt, dass die Untersuchung von nativem AtCCD1 in vitro ermöglicht. Die Hochdurchsatzdurchmusterung von AtCCD1 Mutantenbibliotheken wurde durch die Entwicklung der Expression in 96-well Mikro-Titer-Platten (MTP) ermöglicht. Ein Schwerpunkt der Untersuchungen war die Aktivität und Stabilität von AtCCD1 in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, da diese ebenfalls als Lösungsvermittler der hydrophoben Karotinoide fungieren können. Ebenfalls wurde der Umsatz verschiedener Karotinoide untersucht. Vier komplementäre Mutagenese-Methoden wurden benutzt, um AtCCD1 mittels gerichteter Evolution weiterzuentwickeln. Durch die Kombination der rekombinante Expression in MTP Platten mit neuen Durchmusterungsverfahren wurde ermöglicht, das: (1) Karotinoide aufgrund des Substratverbrauchs, (2) Karotinoide anhand der Fluoreszenz des zentralen Spaltprodukts, (3) Apo-Karotinoide in der Gegenwart von organischen Lösungsmitteln durchgemustert werden können. Diese Methoden wurden benutzt, um AtCCD1 wie folgt zu verbessern: (a) Stabilität in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, (b) Umsetzung verschiedener Karotinoide. Mehrere Schlüssel-Positionen in AtCCD1 wurden identifiziert, z.B. Serin 363 welches für die Substrat Auswahl von Bedeutung ist.

Arabidopsis thaliana Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1 (AtCCD1) is the role model for CCDs, a class of enzymes that cleave highly specific C=C double bonds in carotenoids and apo-carotenoids. CCD1s cleave carotenoids symmetrically and regio-selective at the 9-10 and 9’-10’ position. The active site of CCDs contains a central, heme-free Fe2+, which is coordinated by four histidines. The enzymatic oxidation utilizes molecular oxygen and does not require further cofactors. This unique cleavage step is used in nature to create a huge variety of colorants, flavors and fragrances. It occurs in all branches of life from protozoa, metazoa to plants and fungi. In vitro, organic solvents show an activation effect towards CCD1 cleavage. The understanding of this mechanism has not been resolved up till now. Vast numbers of cleaved carotenoids show a complex chemistry and cannot be synthetized by chemical methods. Utilization of carotenoids as substrates to produce apo-carotenoids is a promising and novel approach. However, recombinant expression of AtCCD1 occurs predominantly as inclusion bodies and thus low enzymatic activity is achieved. CCD1 can be refolded from inclusion bodies, or purified by N- and C-terminal tags. Both methods yield a modified or tagged enzyme, and are limited in their application to characterize CCDs. A tag-free purification protocol was developed and permits investigation of the native AtCCD1 in vitro. High throughput screening (HTS) of AtCCD1 was possible by establishing the expression in a 96 well micro-titer-plate (MTP) format. The activity and stability of AtCCD1 with organic co-solvents was of special interest because it aided solubility characteristics of the hydrophobic carotenoids. In addition, the conversion of different carotenoid substrates was of key interest because of the regio-specificity of the cleavage reaction. Four complimentary mutagenesis methods were used to generate libraries of AtCCD1 in iterative rounds of directed evolution. Development of recombinant MTP expression in combination with novel HTS methods allowed; (I) screening conversion of carotenoids by substrate depletion, (II) fluorescence of the central cleavage product of carotenoids, (III) the conversion of apo-8’-retinal in the presence of organic co-solvents. The methods were applied to evolve AtCCD1 towards; (a) stability in the presence of organic solvents and (b) conversion of carotenoids. Several key-residues for AtCCD1 were determined, including serine 363, which is involved in substrate determination.

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