The regulation of pulmonary vascular permeability by PAF : role of caveolae and acid sphingomyelinase

Yang, Yang; Baumgartner, Werner; Uhlig, Stefan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-35412

The regulation of pulmonary vascular permeability by PAF : role of caveolae and acid sphingomyelinase = Die Regulation der pulmonalen vaskularen Permeabilität durch PAF : die Rolle von Caveolae und der sauren Sphingomyelinase

Yang, Yang

2011

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Yang Yang

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangIV, 125 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Uhlig, Stefan (Thesis advisor) ; Baumgartner, Werner (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-01-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-35412
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/63995/files/3541.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Sphingomyelinphosphodiesterase (Genormte SW) ; Stickstoffmonoxid-Synthase (Genormte SW) ; Stickstoffmonoxid (Genormte SW) ; Lungenödem (Genormte SW) ; Ödem (Genormte SW) ; Steroide (Genormte SW) ; Calcium (Genormte SW) ; Permeabilität (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; Caveolin (frei) ; eNOS (frei) ; endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (frei) ; NO-Synthase (frei) ; NO (frei) ; pulmonales Ödem (frei) ; vaskuläre Permeabilität (frei) ; TRPC-Kanäle (frei) ; TRPC (frei) ; Ca2+ (frei) ; endothelial nitric oxide synthase (frei) ; nitric oxide (frei) ; pulmonary oedema (frei) ; steroids (frei) ; vascular permeability (frei) ; TRPC channels (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Vaskuläre Permeabilität ist eines der Probleme, mit denen in einer pulmonären Entzündung zu rechnen ist. Zunehmende vaskuläre Permeabilität kann im weiteren Verlauf zum Akuten Lungenversagen (Acute Lung Injury, ALI) oder im schweren Verlauf zum Akuten Atemnotsyndrom (Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS) führen, eine Erkrankung, die noch mit hohen Mortalitäten verbunden ist. Ein wichtiger Mediator, der in experimentellen Modellen des ARDS eine wichtige Rolle spielt, ist der Plättchen-aktivierende Faktor , PAF. PAF erhöht die vaskuläre Permeabilität über die Aktivierung zweier Lipid-modifizierender Enzyme: zum einen der Cyclooxygenase, die über gebildetes PGE2 EP3-Rezeptoren aktiviert und zum anderen zur Aktivierung der sauren Sphingomyelinase (ASM), die zur Bildung von Ceramid führt. Der Mechanismus, über den ASM-Metabolite die vaskuläre Permeabilität steuern, sind bislang unbekannt und Gegenstand aktueller Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es aufzuklären, wie ASM die PAF-induzierte endotheliale Permeabilität der Lungengefäße reguliert. Im Speziellen lag der Fokus auf der Rolle der endothelialen NO-Synthese und Ca2+-Fluxe als Reaktion auf PAF. Da Caveolae besonders reich an Sphingolipiden sind, ergab sich die Frage, ob PAF im Bereich der Caveolae angreift und welche Rolle sie in der PAF-induzierten Ödembildung spielen. Aus dieser Fragestellung ergab sich als weiteres Ziel, diese Caveolae aus intaktem Endothel isoliert-perfundierter Rattenlungen anzureichern und diese näher zu charakterisieren. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass PAF-Applikation in isoliert-perfundierten Rattenlungen zur Ödembildung führt und es in der Folge zu einer reduzierten NO-Bildung im Lungenendothel kommt. In Caveolae-reichen Fraktionen des Lungenendothels steigt der Gehalt an Caveolin-1 und endothelialer NO-Synthase (eNOS) nach PAF schnell an. Wiederherstellung normaler endothelialer NO-Konzentrationen durch exogen zugeführte NO-Donatoren schwächten die PAF-induzierten Ödeme ab. PAF-Behandlung führt zu einem Anstieg der ASM-Aktivität in Caveolae-Fraktionen und Perfusion mit ASM senkt die endotheliale NO-Produktion. Pharmakologische Inhibitoren des ASM-Weges wie Imipramin, D609 oder Dexamethason hemmen den PAF-induzierten Anstieg von Caveolin-1 und eNOS in Caveolae, den Abfall der NO-Freisetzung und die Ödembildung. PAF-Applikation führt darüber hinaus in Lungenendothelzellen zu einem Anstieg von intrazellulärem Ca2+. Diese Antwort wird durch Imipramin, den ASM-Inhibitor ARC39 und in ASM-defizienten Mäusen verhindert. Umgekehrt werden endotheliale Ca2+-Fluxe durch Perfusion mit ASM verstärkt. Sowohl der PAF-induzierte [Ca2+]i-Anstieg als auch die Ödembildung können durch den unspezifischen TRPC-Inhibitor SKF96365 gehemmt werden. Screening der Isoformen der TRPC-Kanäle in Caveolae-Fraktionen der Lungenendothelzellen zeigte, dass PAF einen Anstieg der TRPC6-Kanäle induziert, der durch ARC39 geblockt werden kann. Der PAF-induzierte Anstieg des endothelialen [Ca2+]i und Ödembildung wird in TRPC6-defizienten Mäusen nicht beobachtet. Aus den vorliegenden Ergebnissen dieser Arbeit kann geschlossen werden, dass PAF-Applikation ASM-abhängig zu einem Anstieg an Caveolin-1 und zur verstärkten Expression von TRPC6-Kanälen in Caveolae der Lungenendothels führt. Daraus resultiert eine reduzierter NO-Produktion und ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, so dass die Hypothese aufgestellt werden kann, dass die reduzierten NO-Spiegel Endothelzellen für Ca2+-abhängige Permeabilitätsveränderungen sensibilisieren.

Vascular permeability is a hallmark of pulmonary inflammation. In the lungs increased vascular permeability leads to Acute Lung Injury (ALI) and the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), clinical conditions for which mortality remains high. One important mediator that plays a critical role in many experimental models of ALI is the platelet-activating factor (PAF). PAF increases vascular permeability by activation of two lipid modifying enzymes: cyclooxygenase leading to production of PGE2 followed by activation of EP3 receptors and acid sphingomyelinase (ASM) leading to formation of ceramide. The mechanisms by which ASM-metabolites regulate vascular permeability were unknown and were subject of the present studies. The major aim of this work was to investigate the mechanisms by which ASM regulates the PAF-induced increased pulmonary endothelial permeability. Particularly, we focused on the role of NO synthesis and Ca2+ influx in response to PAF. Since caveolae are particularly rich in sphingolipids, we asked whether PAF acts in the realm of caveolae and which role they play in PAF-induced edema formation. Therefore, it was another goal of this thesis to establish a method for the isolation of caveolae from intact endothelial cells of isolated perfused rat lungs and to characterise these caveolae in PAF-treated lungs. In short summary, we found PAF treatment induced edema formation and decreased endothelial NO formation. In caveolae fractions from pulmonary vascular endothelial cells (isolated from perfused rat lungs), the abundance of caveolin-1 and eNOS increased rapidly after PAF perfusion. Restoration of endothelial NO levels with exogenous NO donor mitigated the PAF-induced edema. PAF treatment increased the ASM activity in caveolar fractions and perfusion with ASM decreased endothelial NO production. Pharmacological inhibition of the ASM pathway with imipramine, D609 or dexamethasone blocked the PAF-induced increase of caveolin-1 and eNOS in caveolae, as well as the decrease in NO production and edema formation. PAF treatment also increased endothelial [Ca2+]i. This response was abrogated by Imipramine, the ASM-inhibitor ARC39 and in ASM-deficient mice. Conversely, endothelial [Ca2+]i was increased by direct perfusion with ASM. Both the PAF-induced [Ca2+]i increase and edema formation was blocked by the unselective TRPC inhibitor SKF96365. Screening for a variety of TRPC channels in caveolar fractions from pulmonary vascular endothelial cells revealed that PAF increased the abundance of TRPC6 channels, and this response was abrogated ARC39. The PAF-induced increase in endothelial [Ca2+]i and the edema formation was absent in TRPC6-deficient mice. We conclude that PAF causes ASM-dependent enrichment of caveolin-1 and TRPC6-channels in caveolae of endothelial cells. This leads to decreased NO production and increased Ca2+ levels. We propose that the decreased NO levels sensitize endothelial cells for Ca2+-dependent mechanisms of endothelial permeability.

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