Design, implementation and application of high throughput magnetic tweezers for cell mechanics studies

Chen, La; Fitter, Jörg; Offenhäusser, Andreas

doi:34820

Design, implementation and application of high throughput magnetic tweezers for cell mechanics studies = Design, Implementierung und Anwendung einer Hochdurchsatz-Magnetpinzette für Zellmechanik-Studien

Chen, La

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science-Condensed Matter Physics La Chen

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (VIII, 105 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor) ; Fitter, Jörg (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-056948
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660971/files/660971.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660971/files/660971.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
magnetic particle actuation (frei) ; microrheology (frei) ; cell stiffness (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530

Kurzfassung
In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass die mechanischen Eigenschaften von Zellen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von biologischen Prozessen spielen. Die meisten lebenden Zellen sind klein, empfindlich und sehr heterogen. Oft wurde beobachtet, dass die mechanischen Eigenschaften sehr stark von Zelle zu Zelle variieren. Daher sind mikrorheologische Methoden mit einem hohen Durchsatz von großem Vorteil für Untersuchungen der Zellmechanik. Außerdem werden meistens große mechanische Kräfte benötigt, um Zellen mit hoher Festigkeit zu untersuchen, und um die nichtlinearen mechanischen Eigenschaften von Zellen wie etwa Versteifung oder Fluidisierung zu studieren. Die meisten mikrorheologischen Verfahren sind allerdings auf kleine Kräfte, geringe Beweglichkeit und niedrigen Durchsatz beschränkt. In diesem Zusammenhang wird in der vorliegenden Arbeit der Entwurf und die Realisierung zweier mikrorheometrischer Methoden auf Basis von Magnetpartikeln vorgestellt: Magnetpinzetten (magnetic tweezers, MT) und magnetic twisting cytometry (MTC), mit denen beiden erfolgreich simultan ein hoher Durchsatz, große mechanische Kräfte und hohe Beweglichkeit erzielt wurden. Mit Hilfe dieser Verfahren wurde die Mechanik von Herzmuskelzellen und Gehirnzellen von Ratten charakterisiert. Der erste Teil ist dem Aufbau einer Hochdurchsatz-Magnetpinzette mit drei Polen gewidmet, die zweidimensionale Aktuation von Magnetpartikeln mit hohen mechanischen Kräften erlaubt. Für einen gegebenen Magnetpartikel hängt die maximale Kraft der dreipoligen Magnetpinzette von der Größe des Probenvolumens, von der Breite der Polspitzen und von der Sättigungsmagnetisierung des Spitzenmaterials ab. Um die mechanischen Kräfte zu untersuchen und zu kalibrieren, wurde ein inverses Kraftmodell implementiert, auf dessen Basis mit Hilfe von videogestützter Positionserfassung und numerischer Lösung der Bewegungsgleichungen eine geschlossene Positionsregelschleife für einen Magnetpartikel realisiert wurde. Die Jochspitzen wurden aus einer Nickel-Eisen-Legierung mit sehr hoher Permeabilität gefertigt, um den Strom für die Elektromagneten gering halten zu können. Die Elektronik und die Software zur Spulenstromkontrolle wurden selbst erstellt, um optimale Leistungsdaten zu erhalten. Der Aufbau erlaubt es zum Beispiel, in einem Probenbereich der Größe 60 × 60 µm2 eine Kraft von bis zu 1 nN in beliebiger Richtung auf einen 2.8 µm großen superparamagnetischen Partikel wirken zu lassen, die mit einer Rate von bis zu 1 kHz geändert werden kann. Die in der Praxis erreichbaren Kräfte sind oft niedriger als die rechnerisch vorhergesagten Werte. Dies konnte auf zwei Gründe zurückgeführt werden: einerseits wurde festgestellt, dass die magnetischen Eigenschaften der Jochspitzen durch das Laserschneiden im Fertigungsprozess durch Phasentrennung und ungleichmäßige Aufrauhung verschlechtert werden, andererseits durch einen Effekt der dreidimensionalen Geometrie, der in der zweidimensionalen Simulationsrechnung nicht erfasst werden kann. Außerdem spielt die genaue Spitzengeometrie eine wichtige Rolle hinsichtlich der detaillierten Kraftverteilung. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Korrosion der magnetischen Spitzen bei Kontakt mit mehreren Zellkulturmedien untersucht. Eine deutlich verstärkte Korrosion wurde in Zellmedien zur Kultur von Herzmuskelzellen und Nervenzellen beobachtet, aber nicht im Zellmedium für HEK-Zellen. Um die Korrosion zu unterbinden, wurden die beiden Passivierungsmethoden der elektrochemischen Polypyrrol-Deposition und der pyrolytischen Parylen-C-Deposition untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Qualität der Polypyrrol-Deposition im Bereich der lasergeschnittenen Jochspitzen unzureichend ist. Die Parylen-Deposition hingegen lieferte ausgezeichnete Isolationseigenschaften. Es wurde gezeigt, dass sowohl Herzmuskelzellen als auch primäre Nervenzellen gemeinsam mit Parylen-beschichteten Spitzen lange Zeit kultiviert werden können. Außerdem widersteht die Parylenbeschichtung den wiederholten hohen mechanischen Kräften der magnetischen Aktuation. Im dritten Teil der Arbeit wurde eine neuartige zweidimensionale optische magnetic twisting cytometry (MTC) auf Basis des Magnetpinzetten-Aufbaus implementiert, in der sowohl die Stärke als auch die Richtung des Biege-Magnetfeldes kontrolliert werden können. Sowohl das Polarisations- als auch das Biegefeld werden mittels Elektromagneten erzeugt. Ein separater Hochfeld-Elektromagnet wurde verwendet, um die an die Oberflächen der Zellen gebundenen Magnetpartikel aufzumagnetisieren. Das vorhandene Sechspol-Joch wurde ohne Spitzen verwendet, um das Biege-Magnetfeld aufzubringen. Für Felder kleiner 100 G wurde eine gute Linearität und ein geringer Phasenfehler erreicht. Mittels der Heterodyn-Technik gelang es, die Messfrequenz bis auf 1 kHz hochzutreiben. Im letzten Teil der Arbeit wird die Verwendung der neuentwickelten mikrorheologischen Instrumente beschrieben, um die mechanischen Eigenschaften von Herzmuskelzellen und Gehirnzellen von Ratten zu studieren. Die Kriecheigenschaften und die Frequenzantwort von HL-1-Zellen wurden mit dem System sowohl in Pinzetten- als auch im MTC-Modus untersucht. In beiden Betriebsmodi wurde eine näherungsweise lognormale Verteilung der Steifigkeit der Zellen gefunden. Die Heterogenität der Steifigkeit einzelner Zellen war sehr groß. Bei auf festen Substraten kultivierten HL-1-Zellen wurde ein deutlicher Versteifungseffekt bei niedrigen Frequenzen gefunden, der von der mechanischen Vorspannung durch Myosin-Aktivität abhängt. Außerdem wurden die mechanischen Eigenschaften von Ratten-Neuronen und von Glia-Zellen mittels Magnetpinzette untersucht. Dabei wurde eine wachsende Steifigkeit beider Zellarten mit zunehmendem Reifegrad festgestellt. Im Falle neuronaler Zellen reduziert sich der Exponent des Potenzgesetzes mit wachsender Zellreifung, aber im Falle der Glia-Zellen bleibt er konstant. Besonders im Frühstadium wurde eine hohe mechanische Spannung der Neuronen gefunden. Außerdem werden die Neuronen steifer bei wachsender mechanischer Kraft. Es zeigte sich, dass das Elastizitätsmodul sowohl von Neuronen als auch der Glia-Zellen von der Festigkeit des Substrats abhing.

Recently it has been shown that the mechanical properties of cells play a very important role in various biological processes. Most living cells are small, fragile and highly heterogeneous. It is frequently observed that there is a large inherent variation in mechanical properties from cell to cell. Therefore, high throughput microrheology methods are always favorable in cell mechanics studies. Furthermore, high forces are usually needed to study cells with high stiffness and to analyze nonlinear mechanical properties such as stiffening or fluidization phenomena in cells. However, most available microrheology tools are limited to small force, poor maneuverability, and low throughput. In this context, the current thesis presents the design and implementation of two types of magnetic probe based microrheometers: magnetic tweezers (MT) and magnetic twisting cytometry (MTC), in both of which high throughput, high force (stress), and good maneuverability were successfully achieved at the same time. With the help of these tools, the mechanics of rat cardiomyocytes and brain cells were characterized. The first part of this work focuses on the implementation of a high throughput, high force tri-pole electromagnetic tweezers which can achieve 2D actuation. For a given magnetic bead, the maximal force of tri-pole magnetic tweezers depends on the size of the workspace, the width of the magnetic tips, and on the saturation magnetization of the tip material. In order to conveniently calibrate and study the force behavior, an inverse force model based on a numerical solver and active video tracking based feedback control were implemented. Material with high permeability was adopted as the main yoke to reduce the coil current. The electronics and software were custom-made to achieve high performance. For example, with a workspace of 60×60 µm2, a force of up to 1 nN can be applied on a 2.8 µm superparamagnetic bead in any direction within the plane at a speed of up to 1 kHz. However, the practically achieved saturation forces are usually lower than predicted values, which can be ascribed to two factors: magnetic performance deterioration near the cutting edges of the tips and 3D geometrical effect. The high power laser used in cutting causes segregation and morphological roughness near the cutting edge. Moreover, the geometry of the magnetic tips plays an important role regarding the force behavior. In the second part, the corrosion of the magnetic tips in several cell culture media was characterized. Obvious accelerated corrosion was observed in cardiomyocyte and neuronal cell media, but not in HEK cell medium. Both the electrochemical deposition of polypyrrole and the pyrolytical deposition of parylene-C were examined for passivation. It was found that the quality of polypyrrole deposition is insufficient in the area near the edges of the tweezers tips where they had been laser-cut. However, the parylene coating exhibits excellent isolation properties. Both cardiomyocyte and primary neuronal cell can be cultured on parylene-coated magnetic parts for a long time. In addition, the coated parts can also withstand repeated high magnetic field application. In the third part, based on the magnetic tweezers setup, a novel optical 2D magnetic twisting cytometry was implemented, in which both the strength and direction of the twisting field can be controlled. In the MTC system, both polarization and twisting magnetic field were based on electromagnets. A separate high field electromagnet was utilized to magnetize the ferromagnetic particles bound on the surface of the cells. The existing hex-pole yoke electromagnet, but without tips, was used to apply the twisting magnetic field. When the twisting field is less than 100 G, good linearity and small phase error can be achieved. Using the heterodyning technology, the measurement frequencies were extended up to 1 kHz. In the last part of the thesis, these developed microrheology tools were used to study the mechanical properties of rat cardiomyocytes and brain cells. Both the creep and the frequency response of cardiomyocyte HL-1 cells were characterized with the instrument operated in magnetic tweezers mode and in magnetic twisting cytometry mode, respectively. In both modes, the stiffness of HL-1 cells exhibits approximately log-normal distributions. High heterogeneity of single cell stiffness was also noticed. When HL-1 cells were cultured on a stiff substrate, there was an obvious stiffening effect at low frequency, which depends on the prestress generated by myosin activity. In addition, the mechanical properties of rat neuronal and glial cells were studied with magnetic tweezers. It was found that with increasing maturity, the stiffness of both neuron and glia increases. The power-law exponent of neuronal cells decreases with increasing cell maturity, but the one of glia cells does not change. Especially in early stage, it was found that there is high tension in neurites. Furthermore, the neuronal somas become stiffer with the applied stress. Both the elastic modulus of neurons and glia were also sensitive to the rigidity of the substrate.

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