What can we do with smut? Organic acid production from glycerol with Ustilaginaceae

Zambanini, Thiemo; Schirawski, Jan; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2017-02718

What can we do with smut? Organic acid production from glycerol with Ustilaginaceae = Was können wir mit Brandpilzen machen? Organische Säureproduktion aus Glyzerin mit Ustilaginaceen

Zambanini, Thiemo^RWTH*

2017

VerantwortlichkeitsangabeThiemo Zambanini

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2017

UmfangXV, 132 Seiten : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-86359-492-3

ReiheApplied microbiology ; 5

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Druckausgabe: 2017. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Schirawski, Jan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-12-21

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-02718
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/686218/files/686218.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/686218/files/686218.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Projekte

031A217F - Strategische Allianz ZeroCarbFP - Funktionale Biomasse aus kohlenstoffreichen Abfallströmen, TP 6 (BMBF-031A217F)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ustilago (frei) ; organic acids (frei) ; glycerol (frei) ; strain optimization (frei) ; organische Säuren (frei) ; Glycerin (frei) ; Stammoptimierung (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Der schnell wachsende Bedarf an Energie und Treibstoffen hat zusammen mit dem steigenden Bewusstsein für die schädlichen Auswirkungen fossiler Brennstoffe die Forschung nach erneuerbaren Alternativen, wie Biodiesel, hervorgerufen. Der Produktionprozess von Biodiesel resultiert jedoch in einem enormen Abfallstrom an Rohglycerin, wodurch der ökonomische und ökologische Vorteil geschmälert wird.Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, einen Produktionsprozess für organische Säuren aus Glyzerin mit Ustilaginaceen zu etablieren. Die Biodiversität innerhalb dieser Familie ist gut bekannt und ein Screening von 126 Ustilaginaceen lieferte zwei vielversprechende Kandidaten für die organische Säureproduktion – Ustilago trichophora für Malat und U. vetiveriae für Itakonat. Durch adaptive Laborevolution wurden sowohl die Glyzerinaufnahme als auch die Wachstumsrate beider Stämme verbessert. Anschließend konnte durch Selektion der bestwachsenden Einzelkolonien für jeden Stamm und Medium und Prozessoptimierung die Produktionswerte drastisch verbessert werden.Der Itakonsäuretiter von U. vetiveriae TZ1 wurde auf 35 g L 1 erhöht, welche mit einer Rate von 0.09 g L 1 h 1 produziert wurden. Gleichzeitig wurden 60 g L 1 Malat gebildet. In ersten Ansätzen des „metabolic engineering" durch Überexpression des mitochondrialen Transporters Mtt1 und des Regulators für das Itakonsäurecluster Ria1 aus U. maydis, konnte die Produktion zu Gunsten von Itakonat verschoben werden, wobei der Titer auf das 1,5 fache bzw. 2,0 fache erhöht wurde. Gleichzeitig wurde der Malattiter drastisch um 96 %, bzw. 61 % gesenkt.Für U. trichophora TZ1 wurde der Malattiter auf fast 200 g L 1 erhöht, welche innerhalb von 264 h produziert wurden, wobei eine maximale Produktionsrate von 1.53 g L 1 h 1 erreicht wurde. Da bisher wenig über diesen obskuren U. trichophora Stamm bekannt war, wurden potentielle, native Zielgene für das anschließende „metabolic engineering“ durch de novo Genomsequenzierung identifiziert. Zur Verbesserung der Malatproduktion mit U. trichophora TZ1 wurden bereits existierende U. maydis Werkzeuge, wie Antibiotikamarker und Promotoren untersucht und angepasst. Durch Anwendung dieser Werkzeuge wurden Überexpressionsmutanten für zwei verschiedene Malatdehydrogenasen (Mdh1 und Mdh2), die Pyruvatcarboxylase (Pyc) und zwei unterschiedliche Malattransporter (Ssu1 und Ssu2) erstellt. Während die Überexpression der Pyc die Malatproduktion nicht verbesserte, zeigten die Überexpressionen von Mdh1 und Mdh2 und von den beiden Malattransportern Ssu1 und Ssu2 im Vergleich zur Referenz U. trichophora TZ1 eine bis zu 38 % erhöhte Malatproduktionsrate und eine bis zu 54 % erhöhte Ausbeute in Schüttelkolben. In Bioreaktoren konnte keine erhöhte Produktionsrate für die Überexpressionsmutante von Ssu2 beobachtet werden. Jedoch zeigte dieser Stamm aufgrund einer drastisch reduzierten optischen Dichte eine 29 % erhöhte spezifische Produktionsrate. Zusätzlich wurde die Produktausbeute um das 1,4 fache erhöht. Diese Ergebnisse stärken deutlich die Anwendbarkeit von Ustilaginaceen als industriell wertvolle Produktionsorganismen. Durch diese Valorisierung von Rohglyzerin wird das gesamte Biodiesel Bioraffinerie Konzept sowohl ökonomisch als auch ökologisch verbessert.

The rapidly growing need for energy and fuel combined with an increased awareness of the detrimental influence of fossil resources has evoked the investigation of renewable alternatives, such as biodiesel. The production process of biodiesel, however, results in a huge waste stream of crude glycerol, reducing the economic and ecological advantage.The overall aim of this thesis was to establish a production process for organic acids from biodiesel derived glycerol with Ustilaginaceae. The biodiversity within this family is well known and in a screening of 126 Ustilaginaceae, two promising candidates for organic acid production were found - Ustilago trichophora for malic acid production and U. vetiveriae for itaconic acid production. Glycerol uptake and growth rate of both strains were improved by adaptive laboratory evolution. Selection of the best growing single colony for each strain and medium and process optimization drastically improved the production values.The itaconic acid titer of U. vetiveriae TZ1 was increased to 35 g L 1 produced at a production rate of 0.09 g L 1 h 1. Simultaneously about 60 g L 1 malic acid were formed. In first metabolic engineering approaches overexpressing the mitochondrial transporter Mtt1 and the regulator of the itaconic acid gene cluster Ria1, both from U. maydis, the production values could be shifted in favor of itaconic acid increasing it by 1.5 and 2.0 fold, respectively. Simultaneously, the malic acid titer was reduced by 96 % and 61 %, respectively.For U. trichophora TZ1 the malic acid titer was improved to nearly 200 g L 1 produced within 264 h reaching a maximal production rate of 1.53 g L 1 h 1. Since the knowledge on this obscure U. trichophora was scarce, potential native target genes for metabolic engineering were identified after de novo genome sequencing. To enable the improvement of malic acid production with U. trichophora TZ1 by metabolic engineering, existing tools, such as antibiotic markers and promoters, were investigated and adapted to be suitable for creation of overexpression mutants. Using these tools, overexpression mutants for two different malate dehydrogenases (Mdh1 and Mdh2), pyruvate-carboxylase (Pyc) and two different malic acid transporters (Ssu1 and Ssu2) were generated. While overexpression of Pyc did not improve malic acid production, transformants overexpressing Mdh1 and Mdh2 and malic acid transporters Ssu1 and Ssu2 showed an up to 38 % increased malic acid production rate and an up to 54 % increased yield in shake flasks compared to U. trichophora TZ1. In bioreactor cultivations with the mutant overexpressing Ssu2, an increased production rate could not be observed. Due to a drastically lowered optical density, however, this strain had a 29 % higher specific production rate. Additionally, the product yield was improved by 1.4 fold.These results clearly strengthen the applicability of Ustilaginaceae as industrially valuable production organisms. By this valorization of biodiesel derived crude glycerol, the overall biodiesel bio refinery concept is improved on an economic as well as ecological level.

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