New chloride and proton light-driven pumps : functional characterization and crystallization

Volkov, Dmytro; Büldt, Georg; Engelhard, Martin; Gordeliy, Valentin; Bamberg, Ernst

doi:HT019711981

New chloride and proton light-driven pumps : functional characterization and crystallization

Volkov, Dmytro^RWTH*

2017 & 2018

Verantwortlichkeitsangabesubmitted by Dmytro Volkov MSc

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (106 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2018

Genehmigende Fakultät
Fak05

Hauptberichter/Gutachter
Gordeliy, Valentin (Thesis advisor)^RWTH* ; Büldt, Georg (Thesis advisor) ; Engelhard, Martin (Thesis advisor) ; Bamberg, Ernst (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-11-24

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-224674
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/726092/files/726092.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/726092/files/726092.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Rhodopsins (frei) ; anion pump (frei) ; crystallization (frei) ; optogenetics (frei) ; photocycle (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Proteine können in zwei Hauptarten der Zelllokalisation aufgeteilt werden: Membranproteine und Nicht-Membranproteine. Membranproteine machen etwa ein Drittel aller Proteine aus, die zu einer gegebenen Zeit in den Zellen exprimiert werden, und spielen eine wichtige Rolle im Leben einer Zelle. Membranproteinrezeptoren vermitteln den Informationsfluss von der äußeren Umgebung in die Zelle und modulieren somit die Zellmechanismen bei sich ändernden äußeren Bedingungen. Eine andere Art der Membranproteine - Transporter Proteine - ermöglicht es den Zellen mittels Signalmolekülen zu kommunizieren und so notwendige Nährstoffe aus der Umgebung zu erhalten. Im Rahmen umfangreicher Studien wurde eine neue Methode namens Optogenetik entwickelt. Diese neue Herangehensweise ermöglicht es Zellen in lebendem Gewebe mittels Licht zu kontrollieren. Das Schlüsselelement dieser Methode sind lichtsensitive Membranproteine, die als Funktionsschalter dienen. Die Mehrheit dieser Schalter bilden die sogenannten Rhodopsine. Anders als die direkte Neuronen Anregung mit Elektroden ist die Optogenetik weniger invasiv. Das Rhodopsin-Gen wird dabei in die Zelle injiziert, die dann das Rhodopsin exprimiert und es auf dieselbe Art und Weise in die Zellmembran einbaut wie seine anderen endogenen Proteine. Nach erfolgter Injektion wird die Zelle selbst lichtsensitiv und kann mittels Lichtimpulsen manipuliert werden. Rhodopsine werden im Allgemeinen in zwei Klassen unterteilt: die mikrobiellen Rhodopsine (type I) und die Säuger-Rhodopsine (type II). Trotz des gemeinsamen Namens unterscheiden sich Säuger-Rhodopsine in signifikanter Weise von den mikrobiellen Rhodopsinen. Sie gehören zu der großen Klasse der GPCR- Proteine, was nicht auf die mikrobiellen Rhodopsine zutrifft. Aufgrund von Unterschieden bei Funktionsmechanismen sind die einfacheren mikrobiellen Rhodopsine leichter in den Neurowissenschaften nutzbar. Die Optogenetik nutzt Rhodopsine um Zellmechanismen und deren Interaktion mit dem Gewebe zu untersuchen. Aber jedes Protein hat seine eigenen Charakteristika und es gibt kein ideales „Instrument“ für alle Anwendungen. Jedes Experiment erfordert ein spezifisches „Tool“ (Rhodopsin) mit unterschiedlichen Eigenschaften für optogenetische Untersuchungen. Dies kann zum Beispiel ein schnelles Unterbinden einer zellulären Signaltransduktion sein, wobei es hier keine konkreten Anforderungen an das Langzeit-Verhalten des Proteins gibt. Ein anderes Experiment kann ein Rhodopsin mit vergleichsweise langsamen kinetischen Eigenschaften benutzen, das aber stationär starke Signale während langer Belichtungsphasen braucht. Die große Diversität möglicher optogenetischer Anwendungen erfordert die Entwicklung eines „Tool-Kits“ mit dem die Charakterisierung neuer Rhodopsine einhergeht. Die am häufigsten genutzten Rhodopsine in der Optogenetik sind Kanäle (ChRs, abgeleitet von Channel Rhodopsin). Diese Kanäle ermöglichen einen licht-modulierten, passiven Transport von Ionen entlang eines Gradienten, der zu einer Neuronen-Membran-Depolarisation führt. Der andere Proteintyp, der in der Optogenetik Anwendung findet, ist eine mikrobielle Rhodopsin-Pumpe (Sensor Rhodopsine benötigen trotz erfolgreicher Anwendung weitere Charakterisierungen). Die mikrobiellen Rhodopsin-Pumpen können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: Kationen- und Anionen-Pumpen. Zu der ersten Gruppe gehören Natrium - und Protonenpumpen. Die optogenetischen Anwendungen von Protonenpumpen werden aktuell noch diskutiert, da hier direkt Einfluss auf den pH-Wert genommen werden kann, wohingegen Natriumpumpen hier nur eine geringe Selektivität zeigen und insgesamt eine geringe Leistungsfähigkeit haben. Die Rhodopsine, die in der Regel für eine Membranrepolarisation genutzt werden sind Halorhodopsine (Anionenpumpen-Rhodopsine, HRs), obwohl deren Eigenschaften eine Hyperpolarisation an der Membran herbeizuführen weiterhin diskutiert wird. Das Hauptziel dieser Arbeit war es die Liste an Rhodopsinen, die als Membran-Repolarisations-Tool in der Optogenetik in Frage kommen, zu erweitern. Die Gene vorher nicht charakterisierter Rhodopsine wurden optimiert und optimale Bedingungen für eine Rhodopsinexpression in E.coli Expressionssystemen wurden abgeschätzt. Positive Expressions-Ergebnisse dieser Membranproteine wurden auch in dem vergleichsweise neuen LEXSY-Expressionssystem gezeigt. Zwei Rhodopsine (PGr1 und PMr2) wurden in E.coli exprimiert und kinetisch charakterisiert. Ein Modell mit einem einfach gerichteten Transitionskreis wurde vorgeschlagen. Die funktionale Aktivität einer neuen Anionpumpe mit einer signifikanten Verschiebung in den Blaulichtbereich (im Vergleich zu bekannten Halorhodopsinen) wurde demonstriert. Weiterhin wurde die Pumpaktivität einer neuen Rhodopsin-Protonenpumpe gezeigt. Neben der funktionalen Charakterisierung wurde die Bedeutung einiger strukturellen Änderungen in der neuen Anionenpumpe gezeigt. Kristalle der Protonenpumpe konnten gewonnen werden und weitere Kristallisationsexperimente mit sowohl der Protonenpumpe als auch der Anionenpumpe werden aktuell durchgeführt.

The proteins can be divided into the two major types in terms of the cell localization: membrane proteins and non-membrane proteins. Membrane proteins typically constitute about third of all proteins that cell expresses in a given moment and play important role in a cell's life. So, the membrane protein receptors mediate information flow from the environment into the cell modulating the cell mechanisms in response to the environmental changes. Another type of membrane proteins - the transport proteins - allow cells to communicate by means of signaling molecules and receive necessary nutrients from the environment. The vast studies led to a new method being called the optogenetics. This new approach utilizes the light to control cells in a living tissue. The key elements of this method are the membrane light sensitive proteins that work as the "function switches". And the majority of such "switches" belongs to the rhodopsins. Unlike direct neuron excitation methods via electrodes, the optogenetic approach is less invasive. The rhodopsin gene is injected into the cell allowing latter to express the rhodopsin and to embed it into the membrane the same way as its endogenous proteins. After the injection cell becomes light-sensitive and can be manipulated just with the visible light impulses. The rhodopsins are known for a while and estimated to consist of two major types: microbial rhodopsins (type I) and mammalian rhodopsins (type II). Despite the common name (rhodopsin, derived from Greek for "rose" and "sight"), mammalian rhodopsins significantly differ from those in microorganisms - they belong to a large class of proteins called GPCRs, while their microbial analogues don't. Due to the differences in mechanisms of function, microbial rhodopsins are simpler thus are more convenient to use in the neuroscience. The optogenetics uses rhodopsins to investigate the cells' mechanisms and their interaction within the tissue. But each protein has its own characteristics and there's no ideal "instrument" for all the applications - each experiment requires the specific "tools" (rhodopsins) with different properties for optogenetic investigations. So, one experiment requires fast quenching of neuronal cells signaling thus having no particular requirements to a long-term behavior of the protein, while in the other experiment investigator may use rhodopsins with slow kinetics, but requires the moderately high steady-state signal during the long-term illumination. The large diversity of possible optogenetic applications requires the expansion of a "tool-kit", which in turn leads to a characterization of the new rhodopsins.The most abundantly used rhodopsins in optogenetics are channels (ChRs, derived from channel rhodopsins). These channels provide a light-modulated passive transport of ions along the gradient, which leads to a neuronal membrane depolarization. The other proteins type being applied is microbial pumping rhodopsins (the sensory rhodopsins despite being reported to be successfully applied need further characterization). The microbial pumping rhodopsins can be divided into two major groups: cation pumps and anion pumps. The first includes sodium pumps and proton pumps. The optogenetic application of latter is still disputed due to their ability to directly change the pH, while first posses low selectivity/overall poor performance. Thus, halorhodopsins (anion pumping rhodopsins, HRs), despite the debates on their ability to hyperpolarize membrane beyond the physiological levels, are more common membrane repolarizating rhodopsins. The main goal of this work was to expand the list of rhodopsins that might be used as the membrane repolarization tools in terms of optogenetic. The genes of non-characterised before rhodopsins were optimised and the optimal conditions for rhodopsins expression in E.coli expression system were estimated. The positive results of expression trials of these membrane proteins were as well demonstrated for relatively new LEXSY expression system. The two new rhodopsins PGr1 and PMr2 were expressed in E.coli and characterised from kinetic point of view. The model of unidirectional transitions cycle was proposed. The functional activity of a novel anion pump with significantly shifted into the blue light region (in compare to the reported halorhodopsins) was demonstrated as well as the pumping activity of a new proton-pumping rhodopsin was proven. Along with functional characterisation, the importance of few structural features of novel anion pump was shown. The crystals of proton pump were obtained and the crystallisation trials for both the proton pump and anion pump are still going.

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