Sequenzspezifische Synthese und Anwendung von kovalenten DNA-Protein- und DNA-Oligonukleotid-Konjugaten

Rauser, Miriam; Markus, Albrecht; Weinhold, Elmar

doi:10.18154/RWTH-2020-05500

Sequenzspezifische Synthese und Anwendung von kovalenten DNA-Protein- und DNA-Oligonukleotid-Konjugaten = Sequence-specific synthesis and application of covalent DNA-protein and DNA-oligonucleotide conjugates

Rauser, Miriam^RWTH*

2020

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Miriam Rauser (M.Sc.)

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (V, 132 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Markus, Albrecht (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-05-15

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-05500
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/789863/files/789863.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cofaktoranaloga (frei) ; CpG-Methylierungsdetektion (frei) ; DNA-Methyltransferasen (frei) ; DNA-Protein-Konjugate (frei) ; Fluoreszenzmarkierung (frei) ; SNAP-tag Technologie (frei) ; Sanger-Sequenzierung (frei) ; adressierte DNA-Methylierung (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Aufgrund der Kombination der einzigartigen strukturellen oder kodierenden Eigenschaften der DNA mit den vielseitigen Funktionalitäten von Proteinen können DNA-Protein-Konjugate in vielen Bereichen der Molekulardiagnostik und Biotechnologie eingesetzt werden. Zur Herstellung von sequenzspezifischen kovalenten DNA-Protein-Konjugaten wurde die Methode methyltransferase directed Transfer of Activated Groups (mTAG) mit der SNAP-tag Technologie verknüpft. So wurde zunächst lange DNA sequenzspezifisch mit einer O6-Benzylguanin (BG)-Seitenkette eines Cofaktor AdoInBG35 durch eine DNA-Methyltransferase (DNA-MTase) modifiziert. Mit Hilfe der SNAP-tag Technologie konnte anschließend BG-modifizierte DNA mit verschiedenen SNAP-tag Fusionsproteinen markiert werden. Das SNAP-tag Protein kann dabei mit z.B. DNA-MTasen oder Fluoreszenzproteinen genetisch fusioniert werden und reagiert spezifisch mit diversen BG-Substraten. Ein Anwendungsbereich der kovalenten DNA-Protein-Konjugate befasste sich mit der adressierten DNA-Methylierung und DNA-Markierung. Durch die kovalente Bindung der DNA Cytosin-C5 MTase SNAP-M.MpeI an eine Position auf Plasmid-DNA Litcon30, kann SNAP-M.MpeI nur Sequenzen in der Nähe der kovalenten Bindungsstelle methylieren. Bei dem Vergleich der verschiedenen DNA-Konformationen (linear, nicked und supercoiled) wurde der höchste DNA-Methylierungsgrad der entsprechenden Zielsequenz in der linearen DNA-Konformation erzielt. Unspezifische DNA-Methylierungen entstanden durch die DNA-Verdrillung der nicked und supercoiled Form. Die Verdrillung hat zur Folge, dass die kovalent gebundene SNAP-M.MpeI auch in der Sequenzabfolge weitentfernte, aber räumlich Nahe unspezifische Sequenzen erreichen kann. Aufbauend darauf wurde bei der adressierten DNA-Markierung anstelle der Methylgruppe ein Fluorophor des Cofaktors AdoInTAMRA auf die Zielsequenzen übertragen. Lineare T7-DNA wurde an drei Positionen kovalent mit DNA adenin-N6 MTase SNAP-M.TaqI markiert, wobei nur eine der kovalent gebundenen SNAP-M.TaqI in der Lage war drei Erkennungssequenzen zu erreichen. Die Verwendung von Fluorophoren und T7-DNA, welche im Vergleich zu Plasmid-DNA um ein Vielfaches länger ist, ermöglichte die Analyse mittels Fluoreszenzmikrokopie. Durch Fluoreszenzaufnahmen konnte aus statistischer Sicht die adressierte DNA-Markierung der Zielsequenzen nachgewiesen werden. Unter Verwendung des Fusionsproteins aus SNAP-tag und dem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) konnte ebenfalls Plasmid-DNA pUC19 und T7-DNA im Zuge der kovalenten Konjugatsynthese auch durch Proteine sequenzspezifisch fluoreszenzmarkiert werden. Für die BG-Modifikation wurden DNA Cytosin-C5 MTase M.HhaI und M.TaqI eingesetzt. Die sequenzspezifische Fluoreszenzmarkierung von pUC19 mit SNAP-YFP wurde mittels Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ermittelt. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte das Sequenzmuster der mit SNAP-YFP markierten TaqI-Positionen auf T7-DNA auch ohne DNA-Interkalator aufgrund der hohen Anzahl an TaqI-Sequenzen größtenteils identifiziert werden.Die Entwicklung einer Methode zur CpG-Methylierungsdetektion ist ebenfalls von großem Interesse, da CpG-Methylierungen in Säugetieren bei der Genexpression eine große Rolle spielen, es aber für das Dinukleotid CpG keine methylierungssensitive Restriktionsendonuklease gibt. Für eine solche Methode wurden DNA-Oligonukleotid (ODN)-Konjugate synthetisiert. Die Herstellung der Konjugate erfolgte direkt durch sequenzspezifische Übertragung einer ODN-Seitenkette des Cofaktors AdoInODN durch die CpG-sensitive M.TaqI auf Plasmid-DNA pBR322. M.TaqI erkennt die Sequenz TCGA. Unter dem Einsatz der DNA-ODN-Konjugate bei der Sanger-Sequenzierung wurde die DNA-Polymerase während der Synthese des komplementären Strangs durch die ODN-Markierung an der TaqI-Sequenz blockiert. Dies lies sich im Sequenzierchromatorgramm durch einen Intensitätsabfall nach der TaqI-Sequenz identifizieren. Unter Verwendung von ODN-Seitenketten mit zwei, acht und elf Nukleotiden wurde durch die längeren Seitenketten ODN8 und ODN11 im Vergleich zu ODN2 eine etwas stärker Blockierung erzielt. Wenn nun das Cytosin innerhalb der TaqI-Sequenz methyliert ist, kann M.TaqI die ODN-Seitenkette nicht mehr auf Adenin übertragen und es entsteht kein Intensitätsabfall im Sequenzierchromatogramm. Dies bestätigt somit die CpG-Methylierung.

DNA-protein conjugates can be used in several fields of molecular diagnostics and biotechnology by combination of structural or encoded abilities of DNA with versatile functionality of proteins. Methyltransferase-directed transfer of activated groups (mTAG) method was combined with the SNAP-tag technology for the synthesis of such sequence-specific covalent DNA-protein conjugates. Therefore, long DNA was sequence-specifically modified with the O6-benzylguanine (BG) side chain of a cofactor AdoYnBG35 by DNA methyltransferase (DNA MTase) in the first step. Through SNAP-tag technology BG modified DNA could be labeled with different SNAP-tag fusion proteins in the second step. The SNAP-tag is a mutant of the human O6-alkylguanine DNA alkyl transferase and can be genetically fused to any DNA MTases or fluorescent proteins. It reacts specifically with different BG substrates.An application of covalent DNA-protein conjugates deals with targeted DNA methylation and targeted DNA labeling. As a result of a covalent bond of DNA cytosine-C5 MTase SNAP-M.MpeI to one position on plasmid DNA Litcon30, SNAP-M.MpeI was only able to methylate recognition sequences near the covalent binding site. The comparison of the three plasmid DNA conformations (linear, nicked and supercoiled) revealed that targeted DNA methylation increased, and unspecific DNA methylation decreased from supercoiled to nicked to linear. That can be explained by a more compact structure of the supercoiled form allowing the covalently bound SNAP-M.MpeI not only to methylate nearby sites, but also methylate sites far away in sequence but close in space. On this basis, targeted DNA labeling included the transfer of a fluorophore in the side chain of cofactor AdoYnTAMRA to DNA instead of a methyl group. Linear T7 DNA was three times covalently labeled with DNA adenine-N6 MTase SNAP-M.TaqI. Only one of the covalently bound SNAP-M.TaqI was able to reach and to label three recognition sequences with the fluorophore. The use of fluorophores and T7 DNA, which is many times longer than plasmid DNA, enabled the analysis with a fluorescence microscope. Targeted DNA labeling of the TaqI sequences, which were close to the SNAP-M.TaqI binding site, could be statistically verified through fluorescence images. The T7 DNA was visualized by a DNA intercalator.Plasmid DNA pUC19 and T7 DNA could be also sequence-specific labeled by fluorescent protein due to covalent conjugate synthesis using a fusion protein made of SNAP-tag and the yellow fluorescent protein (YFP). DNA MTases cytosine-C5 M.HhaI and adenine-N6 M.TaqI were used for BG modification. The SNAP-YFP labeled HhaI sequences on pUC19 was verified by electro mobility shift assays (EMSA). T7 DNA has many TaqI sequences spread over the whole strand, resulting in SNAP-YFP fluorescence over the whole strand. Thus, fluorescence images of T7 DNA with SNAP-YFP labeled TaqI sequences showed T7 DNA without any DNA intercalator. The sequence pattern of TaqI was mostly verified by fluorescent SNAP-YFP. The development of a method for CpG methylation detection is promising because CpG methylation in mammalian plays an important part in gene expression. Moreover, there is no restriction enzyme, which recognizes the dinucleotide CpG. DNA oligonucleotide (ODN) conjugates were used for this method. These conjugates were synthesized by sequence-specific transfer of a ODN side chain to plasmid DNA pBR322 by CpG sensitive DNA adenine-N6 MTase M.TaqI. M.TaqI recognize the sequence TCGA. ODN modified pBR322 were then sequenced by Sanger sequencing. DNA polymerase synthesized the complement strand during the Sanger sequencing until it reached the ODN labeled sequence of M.TaqI. The ODN blocked further synthesis, which led to a decreased intensity in the sequencing data after the TaqI sequence. Using three ODN side chains with two, eight or eleven nucleotides, the longer side chains ODN8 and ODN11 resulted in a stronger decline in intensity than ODN2. If the cytosine within the TaqI sequence is methylated, M.TaqI is not able to transfer a ODN side chain to adenine. Therefore, no decreased intensity could be detected in the sequencing data and the CpG methylation is confirmed.

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