Plastic monomer degradation - Engineering Pseudomonas putida KT2440 for plastic monomer utilization

Li, Wing Jin; Wierckx, Nick; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2020-05526

Plastic monomer degradation - Engineering Pseudomonas putida KT2440 for plastic monomer utilization

Li, Wing Jin^RWTH*

2019 & 2020

VerantwortlichkeitsangabeLi Wing-Jin

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus 2019

Umfang1 Online-Ressource (XVII, 162 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-86359-858-7

ReiheApplied microbiology ; 20

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2020

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Wierckx, Nick (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-12-03

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-05526
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/791657/files/791657.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Kunststoffe sind robuste, allgegenwärtige und vielseitige Materialien, die unseren Alltag erleichtern. Aber diese Polymereigenschaften machen sie zu Fluch und Segen zugleich. Die Umweltauswirkungen von Kunststoffen sind immens und es gibt bislang nur wenige Strategien, um mit Kunststoffabfällen umweltfreundlich und wirtschaftlich umzugehen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurde eine Strategie namens Bio-Upcycling entwickelt, die auf eine biotechnologische Umwandlung von Kunststoffabfällen wie PET und PU abzielt. Diese Polymere können durch Enzyme hydrolysiert werden, wobei Monomere wie Ethylenglykol (EG), 1,4-Butandiol (BDO) und Adipinsäure (AA) freigesetzt werden. Diese können von Mikroorganismen, wie dem biotechnologisch relevanten Pseudomonas putida KT2440, als Kohlenstoffquelle genutzt werden, um wertschöpfende Verbindungen herzustellen. Mit dieser Strategie können aus Kunststoffabfällen Wertstoffe hergestellt werden. Diese Arbeit soll es P. putida KT2440 ermöglichen, die Kunststoffmonomere EG, BDO und AA effizient zu metabolisieren. Da P. putida KT2440 nicht auf EG wachsen kann, wurde eine adaptive Laborevolution (ALE) durchgeführt, um die adaptierten Mutanten zu isolieren. Genom-Resequenzierung und Reverse Engineering zeigten, dass die Deletion eines Regulators, gclR, ausreichte, um Wachstum auf EG zu ermöglichen. Die Deletion von zwei zusätzlich identifizierten Genen, PP_2046 und PP_2662, konnte dieses Wachstum weiter verstärken. Mit diesem Wissen wurde der EG-Metabolismus und seine Regulation in P. putida weiter enträtselt. Eine ähnliche ALE-basierte Strategie wurde angewendet, um das Wachstum von BDO zu verbessern und die zugrunde liegenden Abbauwege aufzuklären. Ziele wie PP_2046 wurden durch Genom-Resequenzierung identifiziert, und die Proteomanalyse lieferte Erkenntnisse über die Beteiligung von Dehydrogenasen. Mit der Überexpression des Operons PP_2047-51 wurden höhere Wachstumsraten erreicht. Weitere Charakterisierungen deuten darauf hin, dass BDO zumindest teilweise durch β-Oxidation metabolisiert wird. Der AA-Stoffwechsel wurde in P. putida durch Einführung der heterologen Gene dcaAKIJP aus Acinetobacter baylyi und anschließendem ALE ermöglicht. Darüber hinaus legt die Genom-Resequenzierungsanalyse einen hybriden AA-Stoffwechselweg nahe, an dem DcaAKIJP von A. baylyi in Kombination mit Teilen des nativen Phenylacetat-Abbaus und β-Oxidationswegen beteiligt ist. Zusätzlich dazu, dass P. putida KT2440 auf diesen Substraten individuell wachsen kann, wurde ein Stamm entwickelt, um alle drei dieser aus Kunststoff abgeleiteten Verbindungen zu metabolisieren. Somit legt diese Arbeit die Grundlage für das Bio-Upcycling von PET und PU und ist wegweisend für das rationelle Design eines konsolidierten Kunststoff-degradierenden Organismus.

Plastics are robust, ubiquitous, versatile materials, which make our everyday life easier. But these polymers properties make them both a blessing and a curse. The environmental impact of plastics is immense, and so far, there are only a few strategies to deal with plastic waste in an environmentally friendly and economically feasible way. To tackle this challenge, a strategy called bio-upcycling was developed, aiming for a biotechnological conversion of plastic waste like PET and PU. These polymers can be hydrolysed by enzymes, releasing monomers like ethylene glycol, 1,4-butanediol, and adipic acid. These can be utilized as carbon source by microorganisms like the biotechnological workhorse Pseudomonas putida KT2440 to produce value-added compounds. With this strategy, plastic waste can be used to produce value-added materials. This thesis aims to enable P. putida KT2440 to efficiently metabolize the plastic monomers ethylene glycol, 1,4-butanediol, and adipic acid. Since P. putida KT2440 is not able to grow on ethylene glycol, adaptive laboratory evolution (ALE) was performed to isolate the enhanced mutants. Genome resequencing and reverse engineering revealed that the deletion of one regulator, gclR, was sufficient to enable growth on EG. The deletion of two additionally identified genes, PP_2046 and PP_2662, could further enhance this growth. With this knowledge, ethylene glycol metabolism and its regulation in P. putida was further unraveled. A similar ALE-based strategy was applied to enhance growth on 1,4-butanediol and to enlighten underlying degradation pathways. Targets like PP_2046 were identified via genome resequencing, and proteomic analysis gave insights to the involvement of dehydrogenases. With the overexpression of the operon PP_2047-51, higher growth rates were achieved. Further characterizations indicate that 1,4-butanediol is at least in part metabolized through β-oxidation. Adipic acid metabolism was enabled in P. putida by introducing the heterologous genes dcaAKIJP from Acinetobacter baylyi and subsequent ALE. Furthermore, genome resequencing analysis suggests a hybrid adipic acid metabolic pathway involving DcaAKIJP from A. baylyi combined with parts of native phenylacetate degradation, and β-oxidation pathways. In addition to enabling P. putida KT2440 to grow on these substrates individually, a strain was also engineered to metabolize all three of these plastic-derived compounds. Thus, this work sets the basis for bio-upcycling of PET and PU and leads the way for the rational design of a consolidated plastic degrader.

OpenAccess:
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