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Engineering of heme-dependent monooxygenases towards heterocycle conversion
2020 & 2021
Dissertation, RWTH Aachen University, 2020
Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2021
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-10-02
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-10487
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/804718/files/804718.pdf
Einrichtungen
Projekte
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
P450 (frei) ; directed evolution (frei) ; heterocycles (frei) ; hydroxylation (frei) ; protein engineering (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Aromatische sauerstoff- und stickstoffhaltige Heterozyklen (O- und N- Heterozyklen) kommen in der Natur signifikant häufig vor, da sie eine wichtige Klasse bioaktiver Moleküle darstellen und an einer Vielzahl grundlegender biologischer Funktionen beteiligt sind. Benzo-1,4-Dioxan und Indol sind O- bzw. N-Heterozyklen, und ihre regioselektive Hydroxylierung kann kleine bis makrozyklische Bausteine produzieren, die für antimikrobielle, antigrastische, spasmolytische, antipsychotische, anxiolytische und hepatoprotektive Medikamente von großer Bedeutung sind. Darüber hinaus können diese Heterozyklen für die Herstellung von Pestiziden und Farbstoffen verwendet werden. Für die traditionellen chemischen Synthesen dieser Derivate ist jedoch mindestens eine der folgenden Maßnahmen erforderlich: seltener und kostspieliger Katalysator, Erhitzen, aktive Kühlung und Mehrstufenreaktionen. Die Verwendung von P450-Monooxygeanen kann verwendet werden, um diese Heterozyklen auf effizientere und nachhaltigere Weise zu hydroxylieren.Drei verschiedene Monooxygenasen wurden ausgewählt, um die strukturellen Determinanten der Aktivität über die Benzo-1,4-Dioxan- und Indol-Heterozyklen zu untersuchen. Cytochrom P450 BM3 Monooxygenase aus Bacillus megaterium, P450 Cand_1 Monooxygenase aus Pseudomonas sp. 19-rlim und P450 Cand_10 aus Phenylobacterium zucineum. Jedes P450 wurde verschiedenen technischen Strategien unterzogen: P450 BM3 der epPCR, P450 Cand_1 der Sequenz-Sättigungsmethode (SeSaM) und P450 Cand_10 der Site-saturation-mutagenesis (SSM), um ihre Aktivität gegenüber Benzo-1,4-dioxan und/oder Indol zu verbessern. Es wurden produktspezifische Screeningsysteme entwickelt und angewandt, um verbesserte Varianten in allen generierten Bibliotheken effizient zu identifizieren.Signifikant verbesserte Varianten von P450 Cand_10 und P450 Cand_1 wurden nicht gefunden, P450 Cand_1 zeigte eine schlechte und inkonsistente Expression in 2,2 mL Deep-Well-Platten und für P450 Cand_10 sind die Determinanten für die Aktivität über die getesteten Substrate wahrscheinlich außerhalb des aktiven Zentrums, im Tunnelzugang des aktiven Zentrums und/oder in der Proteinhülle vorhanden. Bei P450 BM3 ermöglichten der Phenolnachweis-4-AAP-Assay sowie die entwickelte Multiplex-Kapillarelektrophorese (MP-CE) den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung des Zielprodukts und der Nebenprodukte in einem 96-Well-Format. Der Einsatz beider Methoden ermöglichte die Identifizierung der Position R255, die bei Substitution durch Leucin im P450 BM3 WT zu einer ≈140-fachen Erhöhung der anfänglichen Oxidationsrate von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) führt (WT: 8. 3 ± 1,3 min-1; R255L: 1168 ± 163 min-1), ≈21-fachem Anstieg der Gesamtumsatzzahl (TTN) (WT: 40 ± 3; R255L: 860 ± 15) und ≈2.9-fachem Anstieg der Kopplungseffizienz (WT: 8,8 ± 0,1%; R255L: 25,7 ± 1,0%). Eine rechnerische Analyse ergab, dass bei der Substitution von R255 durch Leucin (Substitution entfernt vom Häm-Co-Faktor) die zuvor bestehende Salzbrücke zwischen R255 und D217 (in WT) aufhört zu bestehen, wodurch die I-Helix flexibler wird und das Häm neu angeordnet wird, was eine effizientere Hydroxylierung ermöglicht. Diese Verbesserung beschränkte sich nicht auf die Hydroxylierung von Benzo-1,4-dioxan, und es wurde eine ≈20-fache Verbesserung der Umwandlung der O-Heterozyklen, Phthalan, Isochroman, 2,3-Dihydrobenzofuran, Benzofuran und Dibenzofuran gefunden. Die in der Variante R255L beobachtete Verbesserung bietet nützliche Wege zur selektiven und umweltfreundlichen Herstellung von pharmazeutischen Vorläufersubstanzen durch Hydroxylierung in der Spätphase.Aromatic oxygen and nitrogen-containing heterocycles (O- and N- heterocycles) are significantly abundant in nature as they are an important class of bioactive molecules and are involved in a variety of fundamental biological functions. Benzo-1,4-dioxane and indole are O- and N- heterocycles respectively, and their regioselective hydroxylation can produce small to macrocyclic building blocks with great importance for drugs with antimicrobial, antigrastic, spasmolytic, antipsychotic, anxiolytic and hepatoprotective. Additionaly, these heterocycles can be used for the production of pesticides and dyes. However, the traditional chemical syntheses of said derivatives requires at least one of the following: rare and costly catalyst, heating, active cooling and multi-step reactions. The usage of P450 monooxygeanses can be used to hydroxylate these heterocycles in a more efficient and sustainable way. Three different monooxygenases were selected to investigate the structural determinants of activity over the benzo-1,4-dioxane and indole heterocycles. Cytochrome P450 BM3 monooxygenase from Bacillus megaterium, P450 Cand_1 monooxygenase from Pseudomonas sp. 19-rlim and P450 Cand_10 from Phenylobacterium zucineum. Each P450 was subjected to different engineering strategies: P450 BM3 to epPCR, P450 Cand_1 to sequence saturation method (SeSaM) and P450 Cand_10 to site-saturation-mutagenesis (SSM) to improve their activity towards benzo-1,4-dioxane and/or indole. Product-specific screening systems were developed and applied to efficiently identify improved variants in all generated libraries. Significantly improved variants from P450 Cand_10 and P450 Cand_1 were not found, P450 Cand_1 exhibited poor and inconsistent expression in 2.2 mL deep-well plates and for P450 Cand_10 the determinants for activity over the tested substrates are likely to be present outside the active site, in the active site tunnel access and/or protein shell. Regarding P450 BM3, the phenol detection 4-AAP assay, as well as the developed multiplex capillary electrophoresis (MP-CE), enabled simultaneous detection and quantification of the target product and side products in a 96-well format. Employing both methods allowed for the identification of position R255, which when substituted by leucine in the P450 BM3 WT leads to ≈140-fold increase in the initial oxidation rate of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) (WT: 8.3 ± 1.3 min−1; R255L: 1168 ± 163 min−1), ≈21-fold increase in total turnover number (TTN) (WT: 40 ± 3; R255L: 860 ± 15), and, ≈2.9-fold increase in coupling efficiency (WT: 8.8 ± 0.1%; R255L: 25.7 ± 1.0%). Computational analysis revealed that when R255 is substituted by leucine (substitution distant from the heme-cofactor) the previously existing salt-bridge between R255 and D217 (in WT) ceases to exist, introducing flexibility into the I-helix and rearranging the heme, thus allowing a more efficient hydroxylation. This improvement was not limited to hydroxylation of benzo-1,4-dioxane and ≈20-fold improvement in conversion of the O-heterocycles, phthalan, isochroman, 2,3-dihydrobenzofuran, benzofuran, and dibenzofuran was found. The improvement observed in variant R255L provides useful routes to produce pharmaceutical precursors in a selective and environmentally friendly way via late-stage hydroxylation.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT020696960
Interne Identnummern
RWTH-2020-10487
Datensatz-ID: 804718
Beteiligte Länder
Germany
