Advancing automated bioprocess development for industrial platform organisms

Jansen, Roman Pascal; Wiechert, Wolfgang; Oldiges, Marco; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2020-12184

Advancing automated bioprocess development for industrial platform organisms

Jansen, Roman Pascal^RWTH*

2020 & 2021

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Roman Pascal Jansen Master of Science

ImpressumAachen 2020

Umfang1 Online-Ressource (117 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2021

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH* ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-07-01

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-12184
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/808622/files/808622.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
bioprocess development (frei) ; industrial biotechnology (frei) ; laboratory automation (frei) ; microbioreactor (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die industrielle Biotechnologie wird oft durch lange Prozessentwicklungszeiten behindert. Deshalb sind Methoden die beschleunigte Prozessentwicklung erlauben von großem Interesse. Automatisierung, Miniaturisierung und Parallelisierung haben sich dabei als wertvolle Werkzeuge erwiesen, da mehrere integrierte Mikrobioreaktor (MBR)-Plattformen entwickelt wurden, die einen erhöhten Durchsatz für die quantitative Phänotypisierung ermöglichen. Jedoch liegen noch diverse Limitierungen bei den Robotiksystemen vor, wenn man versucht manuelle Laborworkflows zu automatisieren. Deshalb werde neue Workflows in dieser Arbeit entwickelt, die die automatisierte Prozessentwicklung für diverse Plattformorganismen vorantreiben. MBR-Systeme sind für Hefen und bakterielle Mikroorganismen als auch für Batch-Kulturen gut etabliert. In der Industrie werden jedoch häufig Fed-Batch-Prozesse bevorzugt, z.B. um Sauerstofflimitierungen und Substratüberschussinhibierung zu vermeiden. Diese Diskrepanz zwischen Batch-Screening und Fed-Batch-Prozesszielen könnte zur Auswahl falscher Stämme und Parameter führen. Zwei Ansätze für den miniaturisierten Fed-Batch-Prozess wurden entwickelt und für den proteinproduzierenden C. glutamicum als Modellorganismus validiert. Es wurde ein feedback-reguliertes enzym-basiertes slow-release System für die Fed-Batch-Kultivierung in Mikrotiterplatten (MTP) entwickelt, das eine reproduzierbare einseitige pH-Kontrolle sowie eine konstante, lineare oder exponentielle Fütterung für 48 parallele Kultivierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein Workflow, basierend auf Mikrofluidik-MTPs, etabliert, der durch spezifisches Medium- und Feed-Lösungsdesign miniaturisierte Fed-Batch-Kulturen als Stand Alone-Lösung ermöglicht. Filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus sind eines der Arbeitspferde für industrielle Produktionsprozesse. Allerdings wurden sie bisher aufgrund ihrer anspruchsvollen Morphologie nicht vollständig auf den Roboterplattformen implementiert. Neue Arbeitsabläufe, die eine robuste und reproduzierbare MBR-Kultivierung von mikrofilamentösen A. niger, Myzel-Aggregaten von A. giganteus und Pellets von A. carbonarius ermöglichen, wurden etabliert und validiert. Mit maßgeschneiderten Liquid-Handling-Parametern für die Pilzbiomasse wurde eine automatisierte Probennahme und -verarbeitung ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein Workflow entwickelt, der eine automatisierte Morphologie-Analyse ermöglicht. Mit der erfolgreichen Implementierung von mikroskaligen Fed-Batch-Workflows und der Handhabung von Nicht-Standard-Mikroorganismen kann eine Vielzahl von biologischen Fallstudien durchgeführt werden. Insbesondere bei der Kombination der neuartigen Workflows sind neue Möglichkeiten der quantitativen Phänotypisierung möglich, z.B. die automatisierte Morphologie-Analyse aus Fed-Batch-Kultivierung zum Nachweis der Sporenbildung unter Kohlenstofflimitierung. Folglich bleiben Automatisierung, Miniaturisierung und Parallelisierung leistungsfähige Werkzeuge, um die Entwicklung von Bioprozessen zu beschleunigen.

Industrial biotechnology is often hampered through long process development times. Consequently, methods allowing for accelerated process development are of great interest, offering the potential to reduce the time to market. Automation, miniaturization and parallelization have proven to be valuable tools for this, as several integrated microbioreactor (MBR) platforms have been developed, enabling increased throughput for quantitative phenotyping and process development. Nevertheless, these robotic systems still suffer from several limitations when reproducing manual laboratory workflows. Consequently, novel workflows advancing automated process development for various platform organisms are developed in this thesis. MBR systems are well established for yeast and bacterial microorganisms and batch cultivations. However, in industry fed-batch processes are frequently preferred, e.g. to avoid oxygen limitations and substrate excess inhibition. This discrepancy between batch screening and fed-batch process targets might lead to the selection of wrong strains and parameters, due to unsuitable conditions at the screening level. Therefore, novel workflows allowing for microscale fed-batch are in high demand. Two approaches for miniaturized fed-batch were developed and validated for protein producing C. glutamicum as a model organism. A feed-back-regulated enzyme-based slow-release system for fed-batch cultivation in microtiter plates (MTP) was developed, enabling reproducible single-sided pH control as well as constant, linear or exponential feeding for 48 parallel cultivations. Furthermore, a workflow based on microfluidic MTPs was established, where through specific medium and feed solution design, miniaturized fed-batch cultivations as a standalone solution was enabled. Filamentous fungi of the genus Aspergillus are one of the workhorses for industrial production processes. However, so far they have not fully been implemented on the robotic platforms, due to their challenging morphology. Novel workflows allowing the robust and reproducible MBR cultivation of microfilamentous A. niger, mycelial aggregates of A. giganteus and pellets of A. carbonarius were established and validated. With tailor made liquid handling parameters for fungal biomass, automated sample harvest and processing was enabled. Moreover, a workflow allowing automated morphology analysis was developed. With successful implementation of microscale fed-batch workflows and handling of non-standard microorganism, a variety of biological case studies can be performed. Especially when combining these novel workflows new opportunities of quantitative phenotyping are possible, for example, automated morphology analysis from fed-batch cultivation to detect spore formation under carbon limitation. Consequently, automation, miniaturization and paral-lelization remain powerful tools to accelerate bioprocess development.

OpenAccess:
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