Barcoding von genomischer DNA und Anwendung im Bereich des DNA-Mappings

Schilcher, Felix Maximilian; Wöll, Dominik; Weinhold, Elmar

doi:HT020998820

Barcoding von genomischer DNA und Anwendung im Bereich des DNA-Mappings = Barcoding of genomic DNA and application in the area of DNA-mapping

Schilcher, Felix Maximilian^RWTH*

2021

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Felix Maximilian Schilcher

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2021

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Wöll, Dominik (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2021-06-23

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-06512
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/822040/files/822040.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
AdoMet analog (frei) ; DNA labelling (frei) ; DNA mapping (frei) ; DNA methyltransferase (frei) ; mTAG (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die sequenzspezifische Modifikation von DNA mittels methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG) weiterentwickelt. Ein Fokus dieser Arbeit lag auf der Synthese von Analoga des natürlichen Cofaktors von DNA-Methyltransferasen (DNA-MTasen) AdoMet. Darunter fallen sowohl AdoMet-Analoga zur Übertragung von reaktiven, als auch fluoreszierenden und sterisch anspruchsvollen Gruppen. Zur letztgenannten Gruppe gehören Analoga mit Oligodesoxynukleotidmodifikationen. Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität der neuen AdoMet-Analoga in Aktivitätstests mit den DNA-MTasen M.TaqI und M.BseCI untersucht. Im Vergleich zu den Aktivitäten reaktiver und fluoreszierender AdoMet-Analoga, die sich nur geringfügig voneinander unterscheiden, weisen die ODN-modifizierten AdoMet-Analoga grundsätzlich geringere Aktivitäten auf, die außerdem stärker voneinander abweichen. In EMSA-Experimenten konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Übertragung der Seitenkette von AdoYnODN11, die elektrophoretische Mobilität von DNA-Fragmenten mit entsprechender Modifikation verringert. Darauf aufbauend folgten einstufige DNA-Modifikationsreaktionen mit den neu dargestellten AdoMet-Analoga. Die modifizierte DNA wurde daraufhin auf unterschiedliche Weise, sowohl optisch als auch elektronisch, untersucht. Darunter fällt die von externen Kooperationspartnern durchgeführte Analyse mit C-Trap und Nanoporen, aber auch die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von gestreckter genomischer DNA (DNA-Combing). Ein weiteres Augenmerk der vorliegenden Arbeit war die methodische Weiterentwicklung der DNA-Modifikation mittels mTAG-Methode. Dies bezieht sich zum einen auf die Einführung neuer Spezifitäten durch den Einsatz von sogenanntem DNA-Blocking, zum anderen auf die Ausweitung der Methode auf in Agarose eingebettete DNA. Letztlich wurden computergestützte Auswertungsroutinen entwickelt, mithilfe derer die fluoreszenzmikroskopische Analyse von gestreckter und immobilisierter DNA automatisiert wurde um die Güte verschiedener Modifikationsexperimente anhand von Kennzahlen vergleichen zu können.

In the course of this work, the sequence specific modification of DNA using methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG) was further developed. One focus of this work was the synthesis of analogs of the natural cofactor of DNA methyltransferases (DNA-MTases) AdoMet. This includes AdoMet analogs for the transfer of reactive as well as fluorescent and sterically demanding groups. The latter includes analogs with oligodeoxynucleotide modifications. In addition, the enzymatic activity of the new AdoMet analogs was studied using the DNA-MTases M.TaqI and M.BseCI. Compared to that of reactive and fluorescent AdoMet analogs, the activity of ODN-modified AdoMet analogs was generally lower and differed greatly from one another. EMSA experiments were used to show the influence of the sterically demanding modification on electrophoretic mobility of modified DNA-fragments. On this basis, one-step modification reactions were performed using the newly developed AdoMet analogs. The modified DNA was then analyzed using different methods, either optically or electronically. This includes analysis using the so called C-Trap as well as nanopores, which were carried out externally by cooperation partners, as well as the analysis of stretched and immobilized DNA using fluorescence microscopy. Another focus of this work was the experimental development of DNA modification using the mTAG method. On one hand, new specificities were introduced implementing a newly developed labelling strategy called DNA-blocking. On the other hand, the mTAG method was extended to genomic DNA embedded in agarose plugs. Finally, standardized computational analysis routines were developed, which were then used to automate the analysis of the fluorescence microscopy of stretched and immobilized DNA to determine and compare the quality of different modification experiments on the basis of key figures.

OpenAccess:
PDF
(additional files)