Entwicklung einer orthogonalen Markierungsmethode für die Fluoreszenzdetektion epigenetischer DNA-Modifikationen

Käver, Larissa; Albrecht, Markus; Weinhold, Elmar

doi:HT021297231

Entwicklung einer orthogonalen Markierungsmethode für die Fluoreszenzdetektion epigenetischer DNA-Modifikationen = Development of an orthogonal labeling method for fluorescence detection of epigenetic DNA modifications

Käver, Larissa

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Larissa Käver (M.Sc.)

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor) ; Albrecht, Markus (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-03-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-02863
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/843084/files/843084.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
5-Hydroxymethylcytosin (frei) ; 5-Methylcytosin (frei) ; DNA (frei) ; DNA-Markierung (frei) ; Krebs (frei) ; epigenetische Modifikationen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
5-Methylcytosin (5mC) und das Oxidationsprodukt 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) sind epigenetische Modifikationen, die an der Genregulation beteiligt sind und deren globale Veränderungen bei verschiedenen Arten von Krebs festgestellt wurden. [1–4] Die parallele Analyse des Gehaltes von 5mC und 5hmC kann potenziell als Biomarker für die Früherkennung, die Überwachung des Krankheitsverlaufs und das Ansprechen auf eine Behandlung dienen. Derzeitige Techniken zur globalen Quantifizierung von 5mC und 5hmC eignen sich noch nicht für klinische Anwendungen, da dafür beide Modifikationen sehr schnell im untersuchten Gewebe parallel mit unterschiedlichen Fluorophoren quantifiziert werden müssten. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer orthogonalen Methode zur parallelen globalen Fluoreszenzmarkierung der epigenetischen Modifikationen 5mC und 5hmC. Dazu lag ein Fokus dieser Arbeit zunächst auf der Synthese von Analoga des natürlichen Cofaktors AdoMet (1), die verschiedene Vinylmodifikation aufwiesen und in two-step labelling- Reaktionen Anwendung finden sollten. Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität der neuen Cofaktoranaloga in Aktivitätstests mit verschiedenen Adenin- und Cytosin-spezifischen DNA-MTasen untersucht. Darauf aufbauend folgte zunächst die Untersuchung der zweistufigen DNA-Markierung zur Methylierungsdetektion mit den verschiedenen vinylischen Cofaktoranaloga und verschiedenen Tetrazinkonjugaten zur Fluoreszenzanalyse mit hoher und niedriger Markierungsdichte. Die Analyse der fluoreszenzmarkierten DNA erfolgte dabei an immobilisierten und gestreckten DNA-Einzelmolekülen (DNA-Combing) am institutseigenen Fluoreszenzmikroskop. Weiterhin wurde die Methylierungsdetektion zusätzlich durch eine einstufige Markierungsreaktion durch sequenzspezifische Modifikation von verschiedenen DNA-Substraten mit fluoreszierenden Cofaktoranaloga untersucht. Aufgrund der bedeutenden Rolle der epigenetischen Modifikationen 5mC und 5hmC in der Früherkennung von Krebs, wurde ebenfalls eine genomische Human-DNA-Probe (Brustkrebszelllinie, UK Aachen) markiert und von unseren Kooperationspartnern an der Tel Aviv University in Israel hinsichtlich der epigenetischen Information untersucht. Außerdem wurde neben der Methylierung auch die Hydroxymethylierung in einer zweistufigen Markierungsreaktion, sowie die orthogonale Bestimmung von 5mC und 5hmC fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Beide Einzeldetektionen sowie die orthogonale Bestimmung wurden zusätzlich hinsichtlich Reaktionsausbeuten auf kurzen Duplex-ODN mittels rp-HPLC quantifiziert. [1] P. A. Jones, S. B. Baylin, Cell 2007, 128, 683.[2] M. C. Haffner, A. Chaux, A. K. Meeker, D. M. Esopi, J. Gerber, L. G. Pellakuru, A. Toubaji, P. Argani, C. Iacobuzio-Donahue, W. G. Nelson, G. J. Netto, A. M. de Marzo, S. Yegnasubramanian, Oncotarget 2011, 2, 627.[3] M. Ko, Y. Huang, A. M. Jankowska, U. J. Pape, M. Tahiliani, H. S. Bandukwala, J. An, E. D. Lamperti, K. P. Koh, R. Ganetzky, X. S. Liu, L. Aravind, S. Agarwal, J. P. Maciejewski, A. Rao, Nature 2010, 468, 839.[4] A. P. Feinberg, R. Ohlsson, S. Henikoff, Nat. Rev. Genet. 2006, 7, 21.

5-Methylcytosin (5mC) and its oxidation product 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) are epigenetic DNA modifications responsible for gene regulation processes and also known for different types of cancer because of alterations in DNA methylation and DNA hydroxymethylation. [1–4] Parallel analysis of the levels of 5mC and 5hmC can potentially serve as biomarkers for early cancer detection, monitoring of disease progression and response to treatment. Current techniques for global quantification of 5mC and 5hmC are not yet suitable for clinical applications because this would require very rapid quantification of both modifications in the specific tissue using two different fluorophores. Therefore, the aim of this work was to develop an orthogonal method for parallel global fluorescent labeling of the epigenetic modifications 5mC and 5hmC. First focus of this work was the synthesis of analogs of the natural cofactor AdoMet (1) that exhibited different vinyl modifications and could be applied in two-step labeling reactions. Furthermore, the enzymatic activity of the new cofactor analogues was investigated in activity assays with different adenine- and cytosine-specific DNA-MTases. Based on this, the two-step DNA labeling reaction for methylation detection was studied using the different vinylic cofactor analogues and several tetrazine conjugates by analysis of fluorescent labeling with high and low label density. The analysis of the fluorescently labeled DNA was performed on immobilized and stretched single DNA-molecules (DNA combing) using the institute's own fluorescence microscope. Furthermore, methylation detection was additionally examined with one-step labeling reaction by sequence-specific modification of different DNA substrates using fluorescent cofactor analogues. Due to the important role of the epigenetic modifications 5mC and 5hmC in the early detection of cancer, a genomic human DNA sample (breast cancer cell line, UK Aachen) was also labeled and studied by our cooperation partners at Tel Aviv University in Israel with regard to epigenetic information. Besides, in addition to methylation detection, hydroxymethylation was analyzed in a two-step labeling reaction, as well as the orthogonal determination of 5mC and 5hmC by fluorescence microscopy. Both single detections as well as the orthogonal determination were additionally quantified with respect to reaction yields on short duplex ODN by rp-HPLC.[1]P. A. Jones, S. B. Baylin, Cell 2007, 128, 683.[2]M. C. Haffner, A. Chaux, A. K. Meeker, D. M. Esopi, J. Gerber, L. G. Pellakuru, A. Toubaji, P. Argani, C. Iacobuzio-Donahue, W. G. Nelson, G. J. Netto, A. M. de Marzo, S. Yegnasubramanian, Oncotarget 2011, 2, 627.[3]M. Ko, Y. Huang, A. M. Jankowska, U. J. Pape, M. Tahiliani, H. S. Bandukwala, J. An, E. D. Lamperti, K. P. Koh, R. Ganetzky, X. S. Liu, L. Aravind, S. Agarwal, J. P. Maciejewski, A. Rao, Nature 2010, 468, 839.[4]A. P. Feinberg, R. Ohlsson, S. Henikoff, Nat. Rev. Genet. 2006, 7, 21.

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