Structure and dynamics of intrinsically disordered protein

Haris, Luman; Stadler, Andreas; Richtering, Walter

doi:HT021459366

Structure and dynamics of intrinsically disordered protein

Haris, Luman^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Luman Haris Master Biophysiker

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Stadler, Andreas (Thesis advisor)^RWTH* ; Richtering, Walter (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-07-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-06811
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/849453/files/849453.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Intrinsically disordered protein (frei) ; NSE (frei) ; QENS (frei) ; SANS (frei) ; SAXS (frei) ; X-ray scattering (frei) ; dynamics (frei) ; internal friction (frei) ; neutron scattering (frei) ; structure (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Ein Schwerpunkt dieser Dissertation ist die Untersuchung der Struktur und Dynamik von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDP) in Gegenwart des starken chaotropen Guanidiniumchlorids (GndCl). Zu diesem Zweck wurden Experimente mit Kleinwinkelstreuung von Röntgenstrahlung (SAXS) und Neutronen Spin-Echo Spektroskopie (NSE) durchgeführt. Zwei IDP wurden mit diesem Ansatz untersucht: das basische Myelinprotein (MBP) und das Prothymosin Alpha (ProTa). Die Analyse der SAXS-Daten zeigt eine leichte Größenreduktion von MBP bei geringer GndCl Konzentration, gefolgt von einer erneuten Expansion der Kette bei cGndCl > 1 M. Die Schrumpfung wird der anisotropische Dehnung in Verbindung mit der Bildung von Sekundarstruktur und der Umformung von einer expandierten Kette zu einer kompakten Kette mit Gaussstatistik zugeschrieben. NSE Daten wurden mit dem Zimm-Modell mit interne Reibung (ZIF) und dem Zimm-Modell mit Modenauswahl (ZMS) analysiert: Eine signifikante interne Reibung wurde in nativem und leicht denaturiertem MBP gefunden, die bei hohen GndCl Konzentrationen in MBP gegen einen Wert von ungefähr 15 ns konvergiert. Das ZMS-Modell zeigt die Präsenz von dynamisch steife Elementen in MBP, die hochfrequente Zimmmoden effektiv abschneiden. Dieser Mechanismus kann als Quelle der inneren Reibung in strukturell expandiertem MBP identifiziert werden. Zum Vergleich haben wir auch ein komplett entfaltetes IDP namens ProTa untersucht. Hier konnten wir den strukturellen Kollaps von ProTa bei 1 M GndCl bestimmen, wie er zuvor mit FRET beobachtet wurde. Trotz des strukturellen Kollapses bleibt das Protein jedoch aufgrund der hohen negativen Gesamtladung ungeordnet, unabhängig von der GndCl Konzentration. Die Analyse der NSE Spektren mit dem ZIF Modell zeigte das Auftreten von interner Reibung als Reaktion auf die Anwesenheit von GndCl. Interessanterweise wird ähnlich wie bei MBP auch eine interne Restreibung bei hohen GndCl Konzentrationen beobachtet. Die Analyse der NSE-Spektren mit dem ZMS Modell zeigte, dass die interne Reibung die Landschaft der freien Energie beeinflusst und somit die Bindung und die Faltung von Proteinen effektiv reguliert, indem sie ihren Bewegungsbereich lokal einschränkt. Schließlich hat ein direkter Vergleich mit MBP gezeigt, dass die strukturelle und dynamische Veränderung der IDPs innerhalb ihrer jeweiligen ungeordneten Region stattfindet. Wenn sich die Region ausdehnt, verringert und sättigt sich die interne Reibung, wodurch die Lösungsmittelreibung mehr zur Gesamtdynamik beitragen kann. Das zweite Ziel dieser Arbeit ist es die Dynamik des IDPs COR15a und des gefalteten globularen Proteins Myoglobin (Mb) in Reaktion auf Änderungen der Hydrierung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden quasielastische Neutronenstreuexperimente (QENS) in D2O Puffer und in deuteriertem 70% d8-Glycerol Puffer durchgeführt. Die QENS Experimente wurden auf Neutronen Flugzeit- und Rückstreuspektrometern mit unterschiedlichen Energieauflösungen durchgeführt, um einen weiten Zeitbereich von der ps bis zu mehreren ns zu überdecken. Die QENS-Experimente zeigten eine Verlangsamung der globalen Proteindiffusion als auch der internen Dynamik von COR15a und Mb in Anwesenheit von 70% d8-Glycerol im Vergleich zu D2O. Die Verringerung der globalen Proteindiffusion von COR15a und Mb ist ähnlich wie die Änderung der Translationsdiffusion des Lösungsmittels. Dies ist ein erwartetes Verhalten und lässt sich durch die Änderung der Lösungsmittelviskosität erklären. Die Reduktion der internen Dynamik ist signifikant größer für COR15a als fur Mb wenn von 0% d8-Glycerol zu 70% d8-Glycerol gewechselt wird. Betreffend Mb beruht die Reduktion der internen Dynamik rein auf der Änderung der Lösungsmittelviskosität, während bei COR15a eine Kombination aus induzierter Faltung von COR15a und hoher Lösungsmittelviskosität die Reduktion der internen Dynamik verursacht. Ein genauer Vergleich mit Mb - insbesondere in 70% Glycerol - ist schwierig, da die globale Proteindiffusion von Mb in 70% Glycerol sehr langsam ist und außerhalb des Auflösungsbereichs des verwendeten Instruments IN16B mit dem mittleren Auflösungsmodus BATS lieg. Der genaue Wert des globalen Proteindiffusionskoeffzienten von Mb ist jedoch ein wichtiger Parameter fur die QENS Daten von Mb. Diese offene Frage wird zukünftig mit hochauflösender Neutronen-Rückstreuspektroskopie behandelt und gelöst. Diese Experimente konnten im Rahmen der Doktorarbeit nicht durchgeführt werden, da die Forschungsreaktoren aufgrund der COVID19 Pandemie nicht operationsfähig waren.

One focus of this dissertation is the investigation of structure and dynamics of intrinsically disordered proteins (IDPs) in the presence of the strong chaotrope guanidinium chloride (GndCl). For this purpose, small-angle X-ray scattering (SAXS) and neutron spin-echo spectroscopy (NSE) experiments have been performed. Two IDPs have been investigated in this approach: myelin basic protein (MBP) and prothymosin alpha (ProTa). Analysis of the SAXS data reveals a slight size reduction of MBP at low amount of GndCl, which is followed by re-swelling of the chain at cGndCl > 1 M. The shrinking is attributed to the anisotropic elongation that can be traced back to the secondary structure content within MBP and the change from a swollen and expanded chain to a more compact chain with Gaussian chain statistics. Meanwhile, NSE data were analyzed using the Zimm model with internal friction (ZIF) and the Zimm model with mode selection (ZMS): A significant contribution of internal friction was found in native and and slightly denatured MBP, which approaches a value of approximately 15 ns in MBP at high GndCl concentrations. The ZMS model reveals the presence of dynamically rigid elements in MBP that effectively cut of high frequency Zimm modes. This mechanism can be identified as being the source of internal friction in structurally expanded MBP. As comparison, we also studied the fully unfolded IDP ProTa. Here, we could confirrm structural collapse of ProTa at 1 M GndCl as seen previously with FRET. However, despite the structural collapse and due to the high negative net charge, the ProTa protein remains disordered regardless of GndCl concentration. The analysis of NSE spectra with ZIF model revealed the emergence of internal friction as a response to the presence of GndCl. Interestingly, similar to MBP, residual internal friction at high GndCl concentrations is also observed. The analysis of the NSE spectra with ZMS model has shown that internal friction influences the free energy landscape, thus effectively regulating binding and folding of proteins by locally restricting their range of motion. Finally, direct comparison to MBP has shown that the structural and dynamical change in IDPs occur within their respective disordered region. As the region expands, the internal friction reduces and saturates, allowing solvent friction to contribute more to the overall dynamics.The second aim of this work is to investigate the dynamics of the IDP COR15a and the folded globular protein myoglobin (Mb) in response to changes of hydration. For this purpose, quasielastic neutron scattering (QENS) experiments have been performed in D2O buffer and deuterated buffer containing 70% d8-glycerol. QENS experiments have been performed on neutron time-of-flight and backscattering spectrometers with different energyresolutions to probe a broad time range from the ps to several ns. The QENS experiments revealed slowing down of global diffusion and internal dynamics of COR15a and Mb in the presence of glycerol. The reduction of global protein diffusion of COR15a and Mb is similar as the change of translational diffusion of the buffer, which is an expected result and can be explained by the change of buffer viscosity. The reduction of internal dynamics is significantly larger for COR15a as it is for Mb when the buffer is changed from 0% d8-glycerol to 70% d8-glycerol. Concerning Mb, the reduction of internal dynamics is related entirely to the change of buffer viscosity, while for COR15a it appears to be caused by a combination of induced-folding of COR15a in 70% d8-glycerol and the higher solvent viscosity. Proper comparison with Myoglobin, especially in 70% glycerol, is difficult as the overall diffusion of Mb in 70% glycerol is very low and out of the resolution limit of the used instrument IN16B with the medium resolution BATS mode. The exact value of the global diffusion coefficient of Mb is important as input parameter for the fits of the QENS data of Mb. This open question will be addressed and resolved in the future using high resolution neutron backscattering spectroscopy. These experiments could not be performed during the PhD thesis as the research reactors have not been operational during the COVID19 pandemic.

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