Respiratorisches Tissue Engineering : Entwicklung eines respiratorischen Mukosa-Äquivalents

Lüngen, Anja Elisabeth; Cornelissen, Christian Gabriel; Jockenhövel, Stefan

doi:41732

Respiratorisches Tissue Engineering : Entwicklung eines respiratorischen Mukosa-Äquivalents = Respiratory tissue engineering : development of a respiratory mucosa equivalent

Lüngen, Anja Elisabeth^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science RWTH Aachen University, Anja Elisabeth Lüngen geb. Kiel

ImpressumAachen 2022

Umfang54 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2022, Kumulative Dissertation

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Jockenhövel, Stefan (Thesis advisor)^RWTH* ; Cornelissen, Christian Gabriel (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-11-17

Online
URL: http://digitale-objekte.hbz-nrw.de/storage2/2023/01/20/file_8/9302546.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
airways (frei) ; mucocilliary clearance (frei) ; respiratory epithelium (frei) ; tissue engineering (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Patienten mit einer inoperablen Atemwegsstenose, verursacht durch Langzeitintubation, Tracheostomie oder Lungenkrebs, sind mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten und einer geringen Lebensqualität konfrontiert. Bislang gibt es keine erfolgreiche Strategie zum Ersatz der Atemwege, sodass ein hoher Bedarf an neuen Therapieansätzen bei der Behandlung dieser Patienten besteht. In Zukunft könnte ein mittels Tissue Engineering hergestellter Gewebe-Ersatz dieses Problem beheben und bisherige Limitierungen hinsichtlich mechanischer Stabilität, mukoziliärer Reinigung und Vaskularisierung überwinden. Zur Vermeidung von Komplikationen wie Nekrosen, Entzündungen und Infektionen sind einschützendes und funktionales respiratorisches Epithel sowie ein ausgereiftes Gefäß-Netzwerkentscheidend. In dieser Arbeit wurden zunächst die optimalen Kulturbedingungen in Bezug auf die Zusammensetzung des Nährmediums zur in vitro-Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen analysiert. Anschließend wurde ein fibrinbasiertes Tri-Kultur-Modell der Atemwegs-Mucosa mit unterschiedlichen mesenchymalen Stromazellen, respiratorischen Epithelzellen und Nabelschnurvenen-Endothelzellen evaluiert. In der ersten Studie wurde das in vitro-Differenzierungsverhalten primärer respiratorischer Epithelzellen in vier verschiedenen Differenzierungsmedien nach vierwöchiger Kultur der Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche verglichen. Elektronenmikroskopie sowie(immun-)histologische Färbungen zeigten in den meisten Fällen einen mukoziliären Phänotyp der Zellen bei Verwendung einer mit Retinsäure angereicherte Medien-Mischung. Darüber hinaus erwies sich das Gleichgewicht der Konzentrationen von Retinsäure, vaskuläremendothelialen Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor β als bedeutsam für das Differenzierungsergebnis. Niedrige Konzentrationen dieser Wachstumsfaktoren korrelierten mit ausbleibender Ziliierung in Epithelzellen.In der zweiten Studie wurden verschiedene unterstützende Zellarten hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, die mukoziliäre Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen und die durch Nabelschnurvenen-Endothelzellen vermittelte Vaskularisierung in einer fibrinbasierten Tri-Kultur zu fördern. Zusätzlich wurden Ko-Kulturen der drei unterstützenden Zellarten entweder mit Epithel- oder mit Endothelzellen als Kontrollen verwendet. Tri-Kulturen mit mesenchymalen Stromazellen aus dem Knochenmark wiesen die größte Ähnlichkeit mit der nativen Atemwegs-Mucosa im Hinblick auf Ziliierung, Schleimproduktion und Expression von Epithelzellmarkern auf. Danach folgten Kulturen mit nasalen Fibroblasten, während mesenchymale Stromazellen aus Fettgewebe die Zilienbildung nicht förderten. Die Vaskularisierung der verschiedenen Tri-Kulturansätze war vergleichbar, obwohl in den Kulturen mit Zellen aus dem Knochenmark verzweigtere und ausgedehntere Gefäß-Strukturen nachweisbar waren. Die Konzentrationen von pro-angiogenen und entzündungsfördernden Zytokinen waren in Tri-Kulturen im Vergleich zu Co-Kulturen reduziert.Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse tragen zu einer verbesserten Standardisierung der in-vitro-Kultur von respiratorischen Epithelzellen bei und geben wertvolle Einblicke in die Zell-Zell-Interaktionen der Atemwegs-Mucosa. Darüber hinaus stellen die genannten Studieneinen wichtigen Schritt auf dem Weg zu einem ziliierten und vaskularisierten Atemwegs-Ersatzgewebe dar.

Patients diagnosed with irresectable airway stenosis caused by long-term intubation, tracheostomy or lung cancer often face limited therapeutic options and low quality of life. So far, an optimal airway replacement strategy does not exist, leaving an unmet clinical need in the treatment of patients with advanced airway obstruction. In the future, a tissue-engineered substitute could compensate this shortfall by overcoming limitations with regard to mechanical stability, functional mucociliary clearance and proper implant vascularization. However, to prevent complications like inflammation, necrosis and infection, a mature vascular network and a protective mucociliated respiratory epithelium are crucial for any tissue-engineered airwaygraft. In this thesis, the optimal in vitro differentiation conditions in terms of nutrition medium demand for respiratory epithelial cells were initially investigated. This was followed by the evaluation of a fibrin-based in vitro tri-culture model of the respiratory mucosa, consisting of different mesenchymal stromal cells, respiratory epithelial cells and human umbilical veinendothelial cells. The first study compared differentiation behavior of primary human respiratory epithelial cells in four separate differentiation media. Mucociliary differentiation was analyzed after cultivating the cells at the air-liquid interface for four weeks. Electron microscopy, histology and immunohistochemical staining revealed that a retinoic-acid-supplemented mixture most likelyled to a mucociliary phenotype in vitro. Furthermore, enzyme-linked immunosorbent assay results highlighted the importance of a balance in concentrations of retinoic acid, vascularendothelial growth factor, epidermal growth factor and fibroblast growth factor β for the differentiation outcome. On the other hand, low levels of these growth factors in mediasupernatants correlated with absent ciliation in epithelial cells. In the second study, different supporting cell types were compared with regard to their ability to promote mucociliary differentiation of respiratory epithelial cells and vascularization mediated by human umbilical vein endothelial cells in a fibrin-based tri-culture. In addition to the tri-cultures cultivated for four weeks at the air-liquid interface, co-cultures of the threes upporting cell types with either epithelial cells or endothelial cells were used as controls. Tricultures with bone-marrow derived mesenchymal stromal cells as supporting cell type most closely resembled the native respiratory mucosa with regard to ciliation, mucus production and expression of epithelial cell markers. This was followed by human nasal fibroblasts as supporting cell type, while adipose-derived mesenchymal stromal cells did not promoteciliation. Vascularization was comparable between tri-cultures, although more branched andextended vascular-like structures were found in tri-cultures with bone-marrow derived cells. Concentrations of pro-angiogenic and inflammatory cytokines revealed to be reduced in tricultures compared to co-cultures. The results described in this work contribute to an enhanced standardization of the in vitroculture of respiratory epithelial cells and give valuable insight in cell-cell interactions of the respiratory mucosa. Moreover, these studies represent an important step towards a ciliated and vascularized tissue-engineered airway replacement.

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