Synthetic phenylpropanoid pathway for the in vivo production of coniferyl alcohol in Escherichia coli

Kohl, Anna Christiane; Commandeur, Ulrich Heinrich; Blank, Lars M.

doi:HT021864732

Synthetic phenylpropanoid pathway for the in vivo production of coniferyl alcohol in Escherichia coli = Synthetischer Phenylpropanoidweg zur in vivo-Produktion von Coniferylalkohol in Escherichia coli

Kohl, Anna Christiane^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anna Christiane Kohl, Master of Science

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Commandeur, Ulrich Heinrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-02-02

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-03313
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/954643/files/954643.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
coniferyl alcohol (frei) ; in vivo production (frei) ; lignans (frei) ; metabolic engineering (frei) ; phenylpropanoid pathway (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Lignane stellen eine wertvolle Substanzgruppe dar, welche viele gesundheitsfördernde Effekte auf den menschlichen Körper als potenzielle Pharma- und Nutrazeutika besitzen. Eines der bekanntesten Lignane ist (−)-Podophyllotoxin, das als semisynthetisches Derivat für die Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird. Der industrielle Bedarf nach alternativen Produktionswegen ist weiterhin hoch, da die Hauptmethode der Extraktion immer noch von gefährdeten Pflanzen als Ressource abhängt. Deswegen könnte eine kontrollierte mikrobielle Fermentation die wichtigen Lignane in ausreichenden und skalierbaren Mengen zukünftig bereitstellen. Als eine Voraussetzung muss der Vorläufer der Lignansynthese Coniferylalkohol als industrielle Massenware produziert werden. Für eine vor allem kosteneffiziente und wirtschaftlich nachhaltige, grüne Synthese von Coniferylalkohol kann eine Fermentation aus günstigen Rohstoffen wie Glucose, durchgeführt in einem gut untersuchten Produktionsstamm wie Escherichia coli (E. coli) vorteilhaft sein, auch im Hinblick auf eine mögliche kombinierbare Synthese von Lignanen. Die Zielsetzung dieser Dissertation war es, eine mikrobielle Synthese von Coniferylalkohol in E. coli ausgehend von L-Tyrosin oder L-Phenylalanin nach dem pflanzlichen Phenyl-propanoidweg zu etablieren. Im Rahmen von Metabolic Engineering wurden zuerst verschiedene Enzymkandidaten für die wesentlichen zentralen Reaktionsschritte hinsichtlich Desaminierung, C3- und C4-Hydroxylierung und Methylierung evaluiert. Durch die Einteilung des Phenylpropanoidweges in vor- und nachgelagerten Syntheseweg wurden die besten Enzymkombinationen für beide Module untersucht. Die gesamte oder teilweise plasmid-basierte Expression des Phenylpropanoidweges wurde zudem in E. coli BL21(DE3) oder seinen genomintegrierten Abkömmlingen, welche unterschiedliche Genkopien und Promotoren enthalten, umgesetzt. Zuletzt wurden zwei verschiedene Zellassays angewandt und verglichen. Diese Doktorarbeit beschreibt die erste erfolgreiche Anwendung der TALs Flavobacterium johnsoniae (FjTAL) sowie Saccharothrix espanaensis (Sesam8), des Cytochrom P450 Enzyms Rhodopseudomonas palustris (CYP199A2) als C3H und den zwei Methyltransferasen aus Zea mays für die Produktion von Coniferylalkohol aus L-Tyrosin in E. coli. Hervorzuheben ist, dass Kaffeesäure aus L-Phenylalanin zum ersten Mal gewonnen wurde, indem die Bifunktionalität der F185L Mutante von CYP199A2 als C3- und C4-Hydroxylase (C3H/C4H) und die TAL von Rhodotorula glutinis (RgTAL) verwendet wurden. Schließlich konnte die höchste Menge an Coniferylalkohol (~ 850 µM) in wachsenden E. coli-Zellen eines genomintegrierten Stammes erreicht werden. Dieser Titer an Coniferylalkohol, welcher unter nicht-optimierten Bedingungen und in einem Prototypenstamm erzeugt wurde, ist mit einem Literaturwert vergleichbar, bei welchem ein L-Tyrosin überproduzierender Stamm und angepasste Kultivierungsbedingungen eingesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Dissertation schaffen somit eine substanzielle Basis für die Weiterentwicklung einer mikrobiellen Coniferylalkohol-Produktionsplattform.

Lignans constitute a valuable substance group exhibiting many health-promoting effects on the human body as potential pharmaceuticals and nutraceuticals. One of the most popular lignans is (−) podophyllotoxin, which is applied in its semi-synthetic derivatives for the treatment of various types of cancer. The industrial demand for alternative production routes remains high, as the main extraction method still depends on endangered natural plant resources. Thus, the controlled microbial fermentation could provide the important lignans in sufficient and scalable amounts in the future. As one of the preconditions, the precursor for lignan synthesis coniferyl alcohol needs to be produced in industrial bulk. For a foremost cost-efficient and economically sustainable green synthesis of coniferyl alcohol, the fermentation from inexpensive resources such as glucose carried out in well-examined production strains like Escherichia coli (E. coli) can be advantageous also with respect to a possible combinable synthesis of lignans. The objective of this dissertation was to establish the microbial synthesis of coniferyl alcohol in E. coli from L-tyrosine or L-phenylalanine according to the plant phenylpropanoid pathway. In the context of metabolic engineering, different enzyme candidates for crucial central reaction steps concerning deamination, C3- and C4-hydroxylation and methylation were first evaluated. By division of the phenylpropanoid pathway into upstream and downstream pathway, the best enzyme combinations were then investigated for both modules. Furthermore, the complete and partly plasmid-based expression of the phenylpropanoid pathway was realized in E. coli BL21(DE3) or its genome-integrated derivatives containing variable gene copies and promoters. At last, two different cell assays were applied and compared.This thesis describes the first successful application of the TALs from Flavobacterium johnsoniae (FjTAL) and Saccharothrix espanaensis (Sesam8), the cytochrome P450 enzyme from Rhodopseudomonas palustris (CYP199A2) as C3H and the two methyltransferases from Zea mays for the production of coniferyl alcohol from L-tyrosine in E. coli. Noteworthily, caffeic acid was obtained from L-phenylalanine by using the bifunctionality of the CYP199A2 F185L mutant as C3- and C4-hydroxylase (C3H/C4H) and the TAL from Rhodotorula glutinis (RgTAL) for the first time. In the end, the highest amount of coniferyl alcohol (~ 850 µM) was achieved in growing E. coli cells of a genome-integrated strain. This coniferyl alcohol titer, produced under non-optimized conditions and in a prototype strain, is comparable to a value in one literature report, in which an L-tyrosine overproduction strain and adjusted cultivation conditions were used. Thus, the results from this dissertation lay a substantial foundation for the further development of a microbial coniferyl alcohol production platform.

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