The role of keratin intermediate filaments in force handling of epidermal tissues

Schieren, Jana; Spehr, Marc; Leube, Rudolf

doi:HT030365033

The role of keratin intermediate filaments in force handling of epidermal tissues = Die Rolle von Keratin-Intermediärfilamenten in der Kräfte-Handhabung von epidermalen Geweben

Schieren, Jana^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jana Schieren, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Spehr, Marc (Thesis advisor)^RWTH* ; Leube, Rudolf (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-08-30

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-08812
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/968797/files/968797.pdf

Einrichtungen

Projekte

GRK 2415 - GRK 2415: Mechanobiology in Epithelial 3D Tissue Constructs (363055819) (363055819)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Epithelien (frei) ; Genodermatosen (frei) ; Haut (frei) ; Keratin (frei) ; Mechanobiologie (frei) ; epithelia (frei) ; mechanobiology (frei) ; skin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Haut und andere Epithelien sind ständig mechanischer Belastung ausgesetzt. Solche Belastungen werden nicht nur von der äußeren Umgebung ausgeübt, sondern auch von Zellen innerhalb des Epithels erzeugt. Intraepitheliale Stresse tragen zum Aufbau eines funktionellen Gewebes bei und sind notwendig, um die Integrität des Gewebes während Umbau und Wachstum zu erhalten. Das Zytoskelett ist hauptverantwortlich für einen ausgeglichenen Stresszustand. Seine verschiedenen Komponenten weisen unterschiedliche, aber synergetische mechanische Eigenschaften auf und verbinden die Zellen untereinander und mit ihrer extrazellulären Umgebung. Zytoskelett-Netzwerke aus Keratin Intermediärfilamenten tragen maßgeblich zur epithelialen Homöostase und zur dynamischen Anpassung epithelialer Differenzierung bei. Dies wird bei Hautkrankheiten deutlich, die durch Mutationen in Keratin-codierenden Genen verursacht werden. Bei Patient:innen treten verschiedene Phänotypen auf, wie z.B. intraepidermale Blasenbildung, die häufig mit einer von außen auferlegten mechanischen Belastung zusammenhängen. In meiner Arbeit untersuchte ich die Rolle von Keratin Intermediärfilamenten für das Kräftegleichgewicht in epidermalen Monolagen und Gewebeäquivalenten. Durch die Inhibition der anderen Hauptzytoskelettelemente konnte ich feststellen, dass Keratin-Netzwerke maßgeblich an der Erhaltung der Integrität von Keratinozyten-Monolagen beteiligt sind. Mit Hilfe von Traction Force und Monolayer Stress Mikroskopie konnte ich Akkumulationen von hohem Stress in Monolagen identifizieren, denen alle Keratinfilamente fehlten. Stress Anhäufungen traten in Korrelation mit lokalen Defekten des Kräftegleichgewichts auf, was auf eine Rolle von Keratin bei der Dissipation von Kräfteungleichgewichten zur Aufrechterhaltung der mechanischen Homöostase hinweist. In einem nächsten Schritt untersuchte ich Keratinozyten-Monolagen aus Zellen, die Keratinmutationen der blasenbildenden Hautkrankheit Epidermolysis bullosa simplex tragen. Sie waren in der Lage, Spannungen wirksam abzuleiten, zerfielen jedoch bei zusätzlicher mechanischer Belastung. In Experimenten zur Fluorescence Recovery After Photobleach (FRAP) wurden außerdem geringfügige Veränderungen in der Dynamik der mutierten Netzwerke festgestellt. Auch wenn dies zum Versagen der Monolagen beitragen könnte, sind weitere Experimente erforderlich, die die Reaktion auf erhöhte mechanische Belastung berücksichtigen. Als Schritt zur Anwendung von mechanischem Stress in einem epidermisähnlichen Gewebekontext habe ich ein dreidimensionales Modellsystem entwickelt. In diesem Szenario untersuchte ich die Hautkrankheit Pachyonychia congenita (PC), die durch suprabasale Hyperproliferation und gestörte Keratinisierung gekennzeichnet ist. Mit Hilfe von immortalisierten Zelllinien, die von PC Patient:innen stammen, habe ich menschliche Hautmodelle generiert, die stark der natürlichen Haut ähneln. Die charakteristische Verdickung der Epidermis wurde durch eine zyklische Druckbelastung der Hautmodelle hervorgerufen. Insgesamt konnte ich feststellen, dass Keratin-Intermediärfilament-Netzwerke an der Dissipation lokaler Stressungleichgewichte beteiligt sind, um eine mechanisch stabile Monolage aufrechtzuerhalten. Bei der Untersuchung von Keratinozyten, die von EBS-Patient:innen stammen, konnte ich keine auffälligen Phänotypen in nicht gestressten Monolagen feststellen. Darüber hinaus etablierte ich ein dreidimensionales Modellsystem, in dem ich einen Hauptphänotyp von PC mechanisch induzieren konnte. Weiterhin konnte ich zeigen, dass Mutationen in Keratin-Genen die Stabilität des Keratin-Netzwerks unter nicht gestressten Bedingungen beeinträchtigen und dass die Anwendung von mechanischem Stress zu pathognomischen Veränderungen in 3D Zellkulturen führt. Die charakterisierten Paradigmen offenbaren neue Aspekte der Funktion von Keratinfilamenten und dienen als Ausgangspunkt, um Keratin-assoziierte epidermale Krankheitsphänotypen weiter zu entschlüsseln.

The skin and other epithelia have to constantly deal with mechanical stresses. Such stresses are not only imposed by the environment but also generated by cells within the epithelium. Intraepithelial stresses contribute to the establishment of a functional tissue and are necessary to maintain tissue integrity during remodelling and growth. The cytoskeleton is mainly responsible for a balanced stress state. Its different components exhibit different but synergistic mechanical properties and connect cells to each other and their extracellular environment. Cytoskeletal keratin intermediate filament networks are major pillars of epithelial homeostasis and dynamic adaption of epithelial differentiation. This becomes evident in skin diseases that are caused by mutations in keratin-coding genes. Patients encounter different phenotypes, such as intraepidermal blistering or hyperkeratosis, often in correlation with externally imposed mechanical stress. In my work, I examined the role of keratin intermediate filaments for the force balance in epidermal monolayers and tissue equivalents. By inhibition of the other major cytoskeletal elements, I found that keratin networks are significantly involved in the preservation of keratinocyte monolayer integrity. Using traction force and monolayer stress microscopy, I was able to identify accumulations of high stress in monolayers that were depleted of all keratin filaments. Stress clusters occurred in correlation with local defects of the force balance, indicating a role for keratin in the dissipation of force imbalances to maintain mechanical homeostasis. In a next step, I studied keratinocyte monolayers of cells that carry keratin mutations of the skin blistering disease epidermolysis bullosa simplex (EBS). They were able to dissipate stresses effectively, but disintegrated upon additional mechanical stress. Fluorescence recovery after photobleaching experiments furthermore revealed minor changes in mutant network dynamics. While this may contribute to monolayer failure, further experiments are needed that take responses to increased mechanical stress into account. As a step toward mechanical stress application in an epidermal-like tissue context, I established a three-dimensional model system. In this scenario, I investigated the skin disease pachyonychia congenita (PC), which is characterised by suprabasal hyperproliferation and impaired keratinisation. Using immortalised cell lines derived from PC patients, I generated human skin models that closely resemble native skin. The characteristic thickening of the epidermis was induced by application of cyclic compressive load onto the skin models. Taken together, I found that keratin intermediate filament networks are involved in the dissipation of local stress imbalances in order to maintain a mechanically stable monolayer. During examination of keratinocytes derived from EBS-patients I was not able to detect prominent phenotypes in non-stressed monolayers. Furthermore, I established a three-dimensional model system, in which I was able to mechanically induce a major PC phenotype. I was furthermore able to demonstrate that mutations in keratin genes affect keratin network stability in non-stressed conditions and that mechanical stress application induces pathognomonic alterations in 3D cell cultures. The characterized paradigms reveal novel aspects of keratin filament function and serve as starting points to further unravel keratin-associated epidermal disease phenotypes.

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