Toward a CO$_{2}$-neutral biotechnology : itaconate production using CO$_{2}$ derived co-substrates

Ullmann, Lena; Jupke, Andreas; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2023-09908

Toward a CO$_{2}$-neutral biotechnology : itaconate production using CO$_{2}$ derived co-substrates

Ullmann, Lena^RWTH*

2023

VerantwortlichkeitsangabeLena Ullmann

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

ISBN978-3-98555-176-7

ReiheApplied microbiology ; 32

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Druckausgabe: 2023. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Jupke, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-08-29

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-09908
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/971933/files/971933.pdf

Einrichtungen

Projekte

DFG project 390919832 - EXC 2186: Das Fuel Science Center – Adaptive Umwandlungssysteme für erneuerbare Energie- und Kohlenstoffquellen (390919832) (390919832)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die heutige (chemische) Industrie wird von fossilen Rohstoffen dominiert, obwohl diese endlich und zudem umweltschädlich sind. Eine Umstellung von Erdöl-basierten auf nachhaltige und bio-basierte Rohstoffe ist daher zwingend erforderlich, da der Bedarf an Nahrungsmitteln, Energie und Chemikalien weltweit jährlich steigt. Die Nutzung erneuerbarer Kohlenstoffquellen (z.B. Biomasse, CO2, organische Abfälle) ist eine Vorraussetzung für eine Zukunft, die unabhängig von fossilem Kohlenstoff ist. Die Familie der Ustilaginaceae (Brandpilzverwandte) weisen ein vielseitiges Produktspektrum, von beispielsweise organischen Säuren, Polyolen (z. B. Erythrit, Mannit) und extrazellulären Glykolipiden auf, die als Plattformchemikalien mit potenziellen Anwendungen in der Pharma-, Lebensmittel- und chemischen Industrie bekannt sind. Diese Mikroorganismen bieten in Kombination mit der Verwendung alternativer C-Quellen als (Co-) Substrate (z.B. Acetat, Formiat, Glycerin, Lignocellulose) ein hervorragendes Potenzial für die industrielle Biotechnologie und tragen damit potenziell zu den zentralen Herausforderungen der heutigen Zeit bei, einschließlich der CO2-Freisetzung sowie der Landnutzung. Organische Säuren, wie beispielsweise Itaconsäure, können als nachhaltige Alternative zu fossilen Chemikalien fungieren, da ihre funktionellen Gruppen den Einsatz als Baustein in der chemischen Industrie ermöglichen. Ziel dieser Arbeit war es einen effizienten Biokatalysator zu entwickeln, der konkurrenzfähig zu dem derzeitigen Produktionsstamm A. terreus ist. Zur Bioprozessoptimierung wurde der Einsatz von CO2-basierten Co-Substraten, wie Acetat und Formiat, ermöglicht, um das Ziel einer potenziell CO2-neutralen Itaconsäureproduktion zu erreichen. Während der Kultivierungsexperimente wurden 72 Ustilaginaceae für die Verstoffwechselung der Co-Substrate sowie der Itaconsäureproduktion getestet. Dabei stachen zwei Pilze besonders heraus: U. maydis MB215 und U. cynodontis NBRC 9758, welche unter Verwendung der genannten Co-Substrate eine vebesserte Produktion aufwiesen. Mittels Metabolic Engineering unter Verwendung von CRISPR/Cas9- und dem FLP/FRT System wurde ein neuer ITA U. maydis Produktionsstamm entwickelt, welcher ein reduiertes Nebenproduktspektrum (ΔUA, ΔMEL) und eine erhöhte Itaconsäureproduktion aufwies (PetefmttA). Wildtyp- und metabolisch veränderte Stämme (U. maydis und U. cynodontis) wurden daraufhin unter Anwendung der DoE-Methode (Design of Experiment) weiter charakterisiert und optimiert. Die etablierten empirischen Modelle wurden daraufhin verwendet, um die Itaconatproduktion innerhalb des gegebenen Designraums vorherzusagen und das Glukose-zu-Co-Substrat-Verhältnis zu optimieren. Proof-of-Principle-Bioreaktorexperimente demonstrierten das Potential der Verwendung einer externen Keramikmembran, wodurch eine Produktinhibierung von Itaconat vermieden wurde. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse tragen zur nachhaltigen Produktion von Itaconsäure mit dem übergeordneten Ziel einer reduzierten Klimabilanz bei.

Today’s (chemical) industry is founded on fossil-based raw materials (i.e., coal, gas, and oil), despite their negative impacts on our all future, including global warming. A change from fossil to sustainable raw materials is required since the demand for food, energy, and chemicals will keep increasing for the next decades. Using renewable carbon sources (i.e., biomass, CO2, organic waste) will allow a future independent of fossil carbon.Ustilaginaceae, a family of smut fungi, displays a broad product spectrum featuring organic acids (e.g., itaconate, malate, succinate), polyols (e.g., erythritol, mannitol), and extracellular glycolipids (ustilagic acid, mannosylerythritol lipids). These molecules are considered value-added chemicals with potential applications in the pharmaceutical, food, and chemical industry. Importantly, in combination with feeding alternative C-sources as (co-)substrates (e.g., acetate, formate, glycerol, lignocellulose), these microorganisms offer excellent potential for reducing CO2 emissions and land use. Organic acids, such as itaconic acid, can function as sustainable alternatives to fossil-based chemicals, since their functional groups enable their use as building blocks. This work focused on bioprocess optimization and metabolic engineering strategies to establish a sustainable, industrially relevant Ustilaginaceae itaconate production host competitive to Aspergillus terreus. Concerning the bioprocess optimization aspect, acetate and formate were presented Investigating the biodiversity using 72 Ustilaginaceae, Ustilago maydis MB215 and Ustilago cynodontis NBRC 9758 were identified as potential production hosts using the displayed co-substrates. Metabolic engineering was performed using CRISPR/Cas9 genome editing and the FLP/FRT system with marker recycling. This way, a novel itaconate-producing chassis strain was designed characterized by a reduced by-product spectrum (ΔUA, ΔMEL) and the insertion of an overexpressed mttA gene of A. terreus. The wildtype and metabolically engineered strains of U. maydis and U. cynodontis were further optimized by applying the Design of Experiment (DoE) methodology. The established empirical models were used for predicting itaconate production (titer, yield), focusing on the glucose/co-substrate ratio. Acetate assimilation in U. maydis was investigated using off-gas analysis and a 13C-labeling approach. While acetate was not incorporated into itaconate when glucose was present, the induction of the glyoxylate shunt for increased acetate utilization seemed promissing. Extra electrons from formate were supplied from biphasic Ru-catalysed CO2 hydrogenation reactions without any purification, highlighting the many possibilities of chemo- and biocatalysis for carbon capture and utilization. Long-term itaconate production during the stationary phase (weeks rather than days) was achieved using an external ceramic membrane to avoid product inhibition. The here presented results contribute to the production of itaconate from sustainable carbon sources, with the overall goal of reducing land use and carbon footprints.

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