Development of novel analgesics: targeting the RNA-binding protein HuR

Joseph, Benjamin Philipp; Albrecht, Markus; Carloni, Paolo; Rossetti, Giulia

doi:43066

Development of novel analgesics: targeting the RNA-binding protein HuR

Joseph, Benjamin Philipp^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Benjamin Philipp Joseph, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Albrecht, Markus (Thesis advisor)^RWTH* ; Carloni, Paolo (Thesis advisor)^RWTH* ; Rossetti, Giulia (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-03-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-02623
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/980880/files/980880.pdf

Einrichtungen

Projekte

Verbundprojekt: Molekulares Simulation-basiertes rationales Design von Schmerzmitteln auf den Opioid-Rezeptor, Teilvorhaben: Schmerzmitteltestung (01DP19004) (01DP19004)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
In dieser Arbeit wird die Funktion des RNA-bindenden humanen Antigen R Proteins (HuR) und seine Arzneitauglichkeit mithilfe computergestützter Methoden untersucht. HuR reguliert die eukaryotische Genexpression, einschließlich mRNA-Migration, mRNA-Stabilisierung und mRNA-Zersetzung, und beeinflusst so auch die Proteintranslation. Die über 100 verschiedenen labilen mRNAs, die HuR stabilisiert, codieren verschiedene entzündungsfördernde Enzyme, regulatorische apoptopische Proteine, Zellzyklusregulatoren, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Protoonkogene und Tumorsuppressoren. Diese Hintergründe zeigen die Wichtigkeit des Proteins HuR in Bezug auf die Pathologie auf. HuR steht mit einem weit umfassenden Feld verschiedener Krankheitsbilder wie Krebs, entzündlichen Erkrankungen, Schmerzen sowie neurologischen Erkrankungen im Zusammenhang. Daher ist HuR ein interessantes Ziel für die Medikamentenforschung, insbesondre da sich bis dato lediglich ein Molekül in der Stufe präklinischer Tests befindet. Funktionell habe ich mittels Moleküldynamik und darauf aufbauenden enhanced sampling Verfahren berechnet wie das Protein dynamisch an RNA bindet und weitergehend auch den konformationellen Raum des Proteins ohne RNA simuliert. Speziell enhanced sampling Verfahren sind bei der Simulation von RNA-bindenden Proteinen maßgeblich, da diese keine klar definierte Bindetasche besitzen. Es ist daher entscheidend verschiedenen Konformationen dieser flexiblen Proteine zu finden und energetisch zu charakterisieren. In den Simulationen habe ich mich dabei auf die aus zwei RNA-Erkennungsmotiven bestehende Form (RRM1/2) des Proteins beschränkt, da diese die maßgebende für das Bindungsverhalten an die RNA ist. In der Abwesenheit von RNA weist HuR RRM1/2 einen ausgedehnten, flexiblen konformationellen Raum auf in welchem die beiden RNA-Erkennungsmotive über ihre Verbindungssequenz einer mechanischen Sprungfeder ähneln. Für den HuR RRM1/2 RNA-Komplex konnte ich das periodische Wechseln zwischen einem geschlossenen Zustand des Proteins, wo die RNA an beide RNA-Erkennungsmotive gebunden ist und einem offenen Zustand, wo die RNA nur an das erste RNA-Erkennungsmotiv gebunden ist, erfolgreich mittels on-the-fly probability enhanced sampling (OPES) und well-tempered (WT) metadynamics simulieren. In Bezug auf die Arzneitauglichkeit konnte ich durch Docking Experimente neue, potentielle Inhibitoren der HuR-RNA Wechselwirkung finden. Dabei wurden mittels high-throughput virtual screening (HTVS) drei große Molekülbibliotheken an der RNA-Bindetasche des HuR RRM1/2 Proteins gedockt. Die Zielmoleküle wurden im Labor von Prof. Sybille Krauß (Universität Siegen) in vitro in Zellexperimenten auf RNA-Inhibition getestet. So wurden bis jetzt drei Moleküle die qualitativ die Bindung des HuR Proteins an RNA hemmen bzw. ein Molekül, das eben diese Bindung quantitativ hemmt, gefunden. Ich war zusammenfassend in der Lage (i) ein computergestütztes Protokoll für das strukturbasierte Screening neuer Targetmoleküle für HuR bereitzustellen sowie (ii) ein Proof of Concept zu erstellen, wie enhanced sampling Methoden ein Ensemble von Strukturen, ergänzend zu Röntgenkristallstrukturen, für solche Screenings zur Verfügung stellen können. Dieser Punkt ist speziell für die Medikamentenentwicklung zu RNA-Protein Komplexen maßgeblich. Außerdem konnte ich während der Lockdown-Periode einen Beitrag zur COVID-19 Forschung leisten. Meine Arbeitsgruppe war Teil eines EU-Konsortiums zur Entwicklung schneller computergestützter Strategien zur Identifizierung antiviraler Moleküle wobei ich Teil des Teams war, dass für die Untersuchung der 3CL Hauptprotease von SARS-CoV-2 zuständig war.

This thesis aims at understanding the conformational properties and the druggability of the human antigen R (HuR) RNA-binding protein (RBP) using computational methods. HuR regulates eukaryotic gene expression, including mRNA trafficking, mRNA stabilization, mRNA decay and thus influences protein translation. The over 100 labile mRNAs that HuR stabilizes code for various inflammatory enzymes, apoptosis regulatory proteins, cell-cycle regulators, growth factors, cytokines, proto-oncogenes and tumor suppressors. This explains why HuR plays a decisive role in a wide range of pathology classes such as cancer, inflammatory diseases, pain and neurological disorders. Thus, HuR is an important target for drug design campaigns. Yet, so far only one ligand reached the phase of preclinical testing. Here, I have investigated how HuR binds to RNA by exploring its conformational space with and without RNA. My tools of choice are molecular dynamics (MD) and enhanced sampling methods. The latter techniques are especially important in this case, as RBPs do not exhibit a clearly defined cavity where drugs can bind. Therefore, it is important to study the different conformations of this flexible target. I focused on the first two RNA recognition domains of HuR (RRM1/2), which are the first anchoring domains for RNA binding. In the absence of RNA, the HuR RRM1/2 protein shows a broad, flexible conformational space, with a mechanical spring like behavior of the two RRMs connected by a small linker. For the HuR RRM1/2-RNA complex, a switching between two states, i.e. the closed complex with RNA bound to both RRMs and the open complex with RNA only being attached to RRM1 emerged. These intriguing features of HuR could successfully be modeled using on-the-fly probability enhanced sampling (OPES), as well as well-tempered (WT) metadynamics. Regarding HuR drug design, I was able to identify potential low molecular weight inhibitors of HuR-RNA interactions by using molecular docking. New drug candidates were identified by performing a high throughput virtual screening (HTVS) experiment on HuR’s RNA binding cleft using three repurposing compound libraries. The candidate compounds were tested by the lab of Prof. Sybille Krauss (University of Siegen) in cell experiments, with three molecules showing the ability to block RNA binding to HuR and one inhibiting RNA binding in a dose-dependent manner. I was able to (i) set up a computational protocol for structure-based rational screening of new molecules targeting HuR, (ii) provide a proof-of-concept on how enhanced sampling methods can provide ensembles of structures complementary to those from X-ray crystallography for such screenings. This is particularly important for drug design targeting RNA-protein complexes. Finally, I was also able to contribute to the COVID-19 research during the lockdown period. Indeed, I participated in an EU consortium to develop fast computational strategies for antiviral molecules identification. In particular, I was part of the dedicated team on the 3CL main protease of SARS-CoV-2.

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