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DNA methylation biomarkers for deconvolution of hematopoietic subsets in clinical settings



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von M.Sc. Ledio Bocova

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen


Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University


Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
;

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-05-23

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-05868
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/987837/files/987837.pdf

Einrichtungen

  1. Institut und Lehr- und Forschungsgebiet Stammzellbiologie (811002-3 ; 924120)
  2. Fachgruppe Biologie (160000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
CpG sites (frei) ; DNA methylation (frei) ; HSPCs (frei) ; leukocyte deconvolution (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Veränderungen der DNA-Methylierung (DNAm) an bestimmten Stellen im Genom, bieten eine gute Möglichkeit die zelluläre Zusammensetzung des Blutes zu bestimmen. Die klassischen Methoden basieren auf lebensfähigen Zellen und sind daher auf frische Blutproben beschränkt. Im Gegensatz, die epigenetische Analyse ermöglicht die Quantifizierung von Leukozyten in frischen und gefrorenen Proben. In der aktuellen Studie haben wir Proben von gesunden Personen (n = 210) und Patienten mit hämatologischen Erkrankungen (n = 266) entnommen und die DNAm an einzelnen CG-Dinukleotiden (CpG-Stellen) für Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen analysiert. Wir zeigen, dass die epigenetischen Leukozytenzahlen mit Pyrosequenzierung und digital Tröpschen-PCR (ddPCR) bei gesunden und kranken Proben mit den klassischen Leukozytenzahlen korrelieren. Bei einigen Patienten mit hämatologischen Erkrankungen beobachten wir Ausreißer bei den epigenetischen Leukozytenzahlen, die identifiziert werden konnten, wenn die relativen Anteile der Leukozytenuntergruppen nicht 100% betrugen. Für die absolute Leukozytenquantifizierung haben wir eine neuartige ddPCR-basierte Methode entwickelt. Schließlich haben wir den Nachweis erbracht, dass hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) auch durch eine gezielte DNAm-Analyse bestimmt werden können. Die DNAm an drei einzelnen CpG-Stellen in den Genen MYO1D, STK17A und SP140 korrelierten mit der Anzahl der CD34+-Zellen im mobilisierten peripheren Blut und mit der Blastenzahl bei Leukämie. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine gezielte DNAm-Analyse mit Pyrosequenzierung oder ddPCR zur genauen Bestimmung der Anzahl von Leukozytenuntergruppen im Blut verwendet werden kann. Sie kann die Untersuchung von gefrorenem Blut erleichtern. Darüber hinaus bieten wir eine Alternativmethode zur Schätzung der Häufigkeit von HSPCs, der unabhängig von Oberflächenmarkern ist und sich auf gefrorene Proben anwenden lässt. Dies könnte klinische Perspektiven für die Bewertung der Stammzellmobilisierung, der HSPC-Entnahme oder der Blastenzahl bei Leukämie eröffnen.

Hematopoietic differentiation is associated with DNA methylation (DNAm) changes at specific sites in the genome. Our group has previously shown that these epigenetic changes provide a powerful perspective to determine the cellular composition in blood. We established Epi-Blood-Count, for leukocyte quantification based on targeted DNAm analysis at individual cell-specific CG dinucleotides (CpG sites). In contrast to classical methods, it is not based on expression markers, thus enabling differential blood counts in cryopreserved blood samples. The aim of this thesis was to further optimize and validate Epi-blood-Count for clinical applications. To this end, samples from healthy individuals and from patients with hematological disorders that are known to have aberrant DNAm were analyzed. The DNAm at CpGs for granulocytes, monocytes, lymphocytes, CD4 T cells, CD8 T cells, B cells and NK cells were measured with pyrosequencing and digital droplet PCR (ddPCR) and with both methods, epigenetic leukocyte counts correlated strongly with conventional leukocyte counts. In some patients with hematological malignancies, we observed outliers in epigenetic leukocyte counts, which could be identified if the relative proportions of leukocyte subsets did not sum up to 100%. For absolute leukocyte quantification (cells/µl), we established a novel ddPCR-based method that works robustly in samples with oncological background. Lastly, we provide proof of principle of quantification of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with epigenetics. Using publicly available DNAm data of sorted HSPCs we identified three CpG sites with cell-specific methylation located in the genes MYO1D, STK17A, and SP140. Their methylation correlated with CD34+ cell numbers in mobilized peripheral blood and with blast counts in leukemia. These results demonstrate that targeted DNAm analysis with pyrosequencing or ddPCR can be used to accurately evaluate the numbers of leukocyte subsets in blood. It may allow for self-sampling through finger prick and facilitate the retrospective examination of frozen blood. In addition, we provide an alternative approach to estimate the frequency of HSPCs, that is independent of surface markers and applicable to frozen samples. This might provide clinical perspectives to evaluate stem cell mobilization, HSPC harvesting, or blast count in leukemia.

OpenAccess:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online

Sprache
English

Externe Identnummern
HBZ: HT030793425

Interne Identnummern
RWTH-2024-05868
Datensatz-ID: 987837

Beteiligte Länder
Germany

 GO


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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Mathematics, Computer Science and Natural Sciences (Fac.1) > Department of Biology
Publication server / Open Access
Faculty of Medicine (Fac.10)
Public records
811002\-3
Publications database
160000

 Record created 2024-06-16, last modified 2024-12-09


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