Entwicklung enzymatischer Methoden zur DNA-Methylierungssequenzierung

Eiden, Michael; Albrecht, Markus; Weinhold, Elmar

doi:43549

Entwicklung enzymatischer Methoden zur DNA-Methylierungssequenzierung

Eiden, Michael^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Eiden, Michael (M.Sc.)

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Albrecht, Markus (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-06-20

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-07022
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/989927/files/989927.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
CpG-Methylierungsdetektion (frei) ; CpG-methylation detection (frei) ; DNA-Methyltransferasen (frei) ; DNA-Sequenzierung (frei) ; DNA-methyltransferases (frei) ; DNA-sequencing (frei) ; mTAG-Methode (frei) ; mTAG-method (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit bestand darin, verschiedene Methoden zu entwickeln, die eine zuverlässige CpG-Methylierungsdetektion ermöglichen sollten. Zunächst galt es herauszufinden, ob unter Anwendung des TwoStep-Labelings mit sterisch anspruchsvollen ODN und der DNA-Adenin-N6-MTase M.TaqI (WT) eine höhere Modifikationsausbeute der Zielsequenzen auf der zu untersuchenden DNA erreicht werden könnte, was sich wiederum während der Sanger-Sequenzierung in einer Verstärkung des zu beobachtenden Blockings widerspiegeln sollte. Diese Verstärkung des Blockings bzw. die Erhöhung der Intensitätsabnahmen in den Elektropherogrammen konnte in den meisten Fällen der untersuchten bzw. sequenzierten Sequenzen registriert werden. Ein weiteres Themenfeld, das in dieser Arbeit untersucht wurde, behandelte die Frage, inwieweit andere auf DNA übertragene sterisch anspruchsvolle Gruppen, die z.B. Fluorophorgruppen tragen, Einfluss auf den Verlauf bzw. das Ergebnis einer Sanger-Sequenzierung nehmen können. Hierbei spielten insbesondere die Eigenschaften im Aufbau von Fluorophoren eine Rolle, da diese oft aus ausgedehnten aromatischen Systemen mit Ladungen bestehen. Zunächst wurden vier verschiedene fluoreszierende Cofaktoren unter Nutzung der DNA-Adenin-N6-MTase M.TaqI (WT) und der DNA-Cytosin-C5-MTase M.HhaI (tm) mittels Modifikations-/Restriktionstests auf ihre Aktivität hin überprüft. Konnte diese durch einen Schutz der DNA nachgewiesen werden, wurden entsprechende Modifikationsproben angesetzt und der Sanger-Sequenzierung zugeführt. Zusätzlich zu der CpG-Methylierungsdetektion durch die Übertragung großer Gruppen auf entsprechende Erkennungssequenzen mit anschließender Sanger-Sequenzierung wurde ein weiterer Weg eingeschlagen, um die Detektion von CpG-Methylierungen detektieren zu können. Dazu sollte ein Cofaktor ermittelt, synthetisiert und auf seine Aktivität hin untersucht werden, der sich für die Durchführung einer Nanopore-Sequenzierung eignen könnte. Dieser Cofaktor bzw. die zu übertragende Gruppe sollte dabei zwei Haupteigenschaften aufweisen. Einerseits sollte sie nicht zu groß sein, um eine mögliche Blockierung der verwendeten Nanopore zu unterbinden, und andererseits sollte diese eine Ladung tragen, um einen möglichst hohen Einfluss auf den während der Nanopore-Sequenzierung gemessenen Ionenstrom auszuüben. Aus diesen Überlegungen heraus wurde der Cofaktor Carboxy-AdoMet synthetisiert, der eine Carboxylgruppe trägt. Zunächst wurden Aktivitätstests mit λ-DNA sowie mit verschiedenen CpG-methylierungsabhängigen DNA-MTasen, nämlich den Wildtypen von M.TaqI, M.MpeI und M.SssI sowie verschiedenen Varianten, durchgeführt. Für die Durchführung der Nanopore-Sequenzierung sollte eine methylierungsabhängige DNA-MTase verwendet werden, die eine 5`-CG-3`-Erkennungssequenz aufweist. Daher wurde für die Carboxymethylierung von zu untersuchender T7-DNA die DNA-MTase M.MpeI (dm) eingesetzt, weil diese die höchste Aktivität mit dem Cofaktor Carboxy-AdoMet aufwies. Da in den vorangegangenen Modifikations-/Restriktionstests λ-DNA verwendet wurde, wurde mit T7-DNA und M.MpeI (dm) ebenfalls zur Überprüfung ein Modifikations-/Restriktionstest durchgeführt, wobei die Aktivität auch hier ähnlich ausfiel. Aufbauend auf diesem Resultat wurde T7-DNA modifiziert und der Nanopore-Sequenzierung zugeführt. Die Ergebnisse dieser Sequenzierungen ergaben, dass eine Carboxymethylierung zu einem, im Vergleich zu unmodifizierter DNA, veränderten Verlauf der Spannungssignale um die und innerhalb der CpG-Sequenzen führt.

The overall aim of this work was to develop different methods to enable reliable CpG methylation detection. The first aim was to find out whether a higher modification yield of the target sequences on the DNA under investigation could be achieved using two-step labeling with sterically demanding ODN and the DNA adenine N6 MTase M.TaqI (WT), which in turn should be reflected in an increase in the blocking observed during Sanger sequencing. This increase in blocking or the increase in intensity decreases in the electropherograms could be registered in most cases of the sequences examined or sequenced. A further topic investigated in this work was the question of the extent to which other sterically demanding groups transferred to DNA, such as those carrying fluorophore groups, can influence the course or result of Sanger sequencing. In particular, the properties of the structure of fluorophores played a role here, as these often consist of extended aromatic systems with charges. Initially, four different fluorescent cofactors were tested for their activity using the DNA adenine N6 MTase M.TaqI (WT) and the DNA cytosine C5 MTase M.HhaI (tm) by means of modification/restriction tests. If this could be detected by protecting the DNA, corresponding modification samples were prepared and subjected to Sanger sequencing. In addition to CpG methylation detection by transferring large groups to corresponding recognition sequences with subsequent Sanger sequencing, a further approach was taken to detect CpG methylation. For this purpose, a cofactor that could be suitable for nanopore sequencing was to be identified, synthesized and tested for its activity. This cofactor or the group to be transferred should have two main properties. On the one hand, it should not be too large in order to prevent possible blocking of the nanopore used, and on the other hand, it should carry a charge in order to exert the greatest possible influence on the ion current measured during nanopore sequencing. Based on these considerations, the cofactor Carboxy-AdoMet was synthesized, which carries a carboxyl group. First, activity tests were performed with λ-DNA and with different CpG methylation-dependent DNA MTases, namely the wild types of M.TaqI, M.MpeI and M.SssI as well as different variants. A methylation-dependent DNA MTase with a 5`-CG-3` recognition sequence should be used for nanopore sequencing. Therefore, the DNA-MTase M.MpeI (dm) was used for the carboxymethylation of T7 DNA to be analyzed, because it showed the highest activity with the cofactor carboxy-AdoMet. Since λ-DNA was used in the previous modification/restriction tests, a modification/restriction test was also carried out with T7-DNA and M.MpeI (dm) for verification purposes, and the activity was also similar here. Based on this result, T7 DNA was modified and subjected to nanopore sequencing. The results of this sequencing showed that carboxymethylation leads to an altered course of the voltage signals around and within the CpG sequences compared to unmodified DNA.

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