DNA methylation changes during culture expansion of chimeric antigen receptor T cells correlate with clinical outcome

Salz, Lucia; Zenke, Martin; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion; Wagner, Wolfgang

doi:10.18154/RWTH-2024-11794

DNA methylation changes during culture expansion of chimeric antigen receptor T cells correlate with clinical outcome

Salz, Lucia^RWTH*

2024 & 2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Lucia Salz, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2025

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wagner, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Zenke, Martin (Thesis advisor)^RWTH* ; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-12-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-11794
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/998995/files/998995.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
CAR T cells (frei) ; DNA methylation (frei) ; EPIC array (frei) ; cell and gene therapy (frei) ; immunology (frei) ; immunotherapy (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Chimäre Antigenrezeptor (CAR) T Zellen sind autologe Zellen, die entwickelt wurden, um spezifische Antigene auf Krebszellen zu erkennen. Die Produktion von CAR T Zellen umfasst einen komplexen in vitro Expansionsprozess. Frühere Studien haben gezeigt, dass andere hämatopoetische und mesenchymale Zelltypen während der Kulturexpansion charakteristische DNA Methylierungs- (DNAm) Veränderungen erfahren. In dieser Studie wollten wir feststellen, ob der Herstellungsprozess von CAR T Zellen ebenfalls zu aberranten DNAm Signaturen führt und in welchem Zusammenhang diese Veränderungen mit den klinischen Ergebnissen stehen. Hierfür haben wir CAR T Zellen bis zu drei Wochen in vitro expandiert und DNAm Veränderungen analysiert. Unsere Ergebnisse zeigten einen kontinuierlichen Anstieg der DNAm während der Kulturexpansion, insbesondere in einem Subset von 336 CpG-Dinukleotiden (CpGs), die eine starke lineare Korrelation mit der Kulturdauer aufwiesen. Die gezielte Bisulfit-Amplicon-Sequenzierung mehrerer kulturassoziierter Loci zeigte, dass benachbarte CpGs auf denselben DNA-Strängen nicht kohärent methyliert wurden, was auf das Auftreten stochastischer DNAm-Veränderungen neben regulierten Prozessen hindeutet. Als wir die DNAm-Niveaus dieser kulturassoziierten Signatur in CAR T Zellen aus drei klinischen Studien mit Leukämie- und Lymphompatient*innen untersuchten, waren höhere DNAm-Niveaus bei 14 spezifischen CpGs signifikant mit einem reduzierten Langzeitüberleben verbunden. Anwendung dieser 14 CpGs in einem linearen Regressionsmodell zur Schätzung der Kulturdauer zeigte, dass längere Kulturzeitvorhersagen mit einem schlechteren Überleben korrelierten, was darauf hinweist, dass eine verlängerte in vitro Expansion die T Zell Funktionalität beeinträchtigen kann. Zusätzliche RNA-Sequenzierungsanalysen zeigten, dass Hypermethylierung mit der Repression von Genen, die für die T Zell Funktion entscheidend sind, wie TCF7, RUNX1 und TOX verbunden waren. Unsere Ergebnisse betonen die Notwendigkeit, ex vivo Herstellungszeiten zu optimieren und möglicherweise zu verkürzen, um die Funktionalität der T Zellen zu erhalten und die Behandlungsergebnisse zu verbessern.

Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells are autologous cells engineered to target antigens expressed on cancer cells. The production of CAR T cells involves a complex in vitro expansion process. Previous studies have reported that other hematopoietic and mesenchymal cell types acquire distinct DNA methylation (DNAm) changes during culture expansion. In this study, we aimed to determine whether the CAR T cell manufacturing process also results in aberrant DNAm signatures and to understand the implications of these changes on therapeutic outcomes. To investigate this, CAR T cells were expanded in vitro for up to three weeks, and DNAm changes were analyzed using the Infinium MethylationEPIC BeadChip. Our results indicated a continuous increase in DNAm during culture expansion, particularly in a subset of 336 CpG dinucleotides (CpGs) that exhibited a strong linear correlation with culture time. Targeted bisulfite amplicon sequencing of several culture-associated loci revealed that neighboring CpGs on the same DNA strands were not coherently regulated, suggesting the occurrence of stochastic DNAm changes alongside regulated processes. When we investigated DNAm levels of this culture-associated signature in CAR T cells from three clinical trials involving leukemia and lymphoma patients, higher DNAm levels at 14 specific CpGs were significantly associated with reduced long-term survival post-infusion. When these 14 CpGs were applied within a linear regression model for estimating culture time, longer culture time predictions correlated with decreased survival, indicating that in vitro expansion may compromise T cell functionality. To link these culture-associated DNAm changes to biological functions, we integrated RNA sequencing analysis to explore correlations between DNAm and gene expression patterns. Hypermethylation was associated with transcriptional repression in genes critical for T cell function, such as TCF7, RUNX1, and TOX. Taken together, our findings indicate that optimizing and potentially reducing ex vivo manufacturing times may benefit T cell functionality and improve patient outcomes by minimizing culture-associated DNAm changes.

OpenAccess:
PDF
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