Verbesserung der Substrataufnahme in Ganzzellbiotransformationen mit Escherichia coli

Hofzumahaus, Sebastian; Schallmey, Anett

doi:4899

Verbesserung der Substrataufnahme in Ganzzellbiotransformationen mit Escherichia coli = Improvement of the substrate uptake rates in whole-cell biotransformations with Escherichia coli

Hofzumahaus, Sebastian (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sebastian Hofzumahaus

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangIX, 165 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schallmey, Anett (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-11-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-48998
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/228826/files/4899.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cytochrom P-450 (Genormte SW) ; Biokatalyse (Genormte SW) ; Steroide (Genormte SW) ; Carrier-Proteine (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Disulfidbrückenbindung (frei) ; Periplasmatische Expression (frei) ; Sekretionssignalpeptid (frei) ; Coexpression (frei) ; Disulfide bond (frei) ; Periplasmic expression (frei) ; Secretion signal peptide (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der Biokatalyse können Feinchemikalien und Massenprodukte mit Hilfe von isolierten Enzymen oder ganzen Zellen umweltfreundlich synthetisiert werden. In der Ganzzellbiokatalyse werden dabei in der Regel (rekombinante) Mikroorganismen eingesetzt, wobei die Umsetzung von Substraten durch intrazelluläre Enzyme erfolgt. Dies setzt eine effiziente Aufnahme der Substrate in die Zellen voraus. Allerdings ist diese Voraussetzung gerade bei großen hydrophoben Substraten häufig nicht gegeben. Durch den Zellwandaufbau gramnegativer Bakterien werden große hydrophobe Moleküle nur mit recht langsamen Diffusionsraten aufgenommen, weshalb häufig organische Lösungsmittel, Detergenzien, Tenside und Cyclodextrine eingesetzt werden, um die Löslichkeit hydrophober Substrate und die Permeabilität der Zellwände zu verbessern. Diese sind jedoch entweder sehr teuer oder können zur Destabilisierung der Zellen führen. Um diese Probleme zu vermeiden, wurde in der vorliegenden Arbeit die Verbesserung des Substratumsatzes durch Verwendung von Elicitinen getestet. Als Beispielreaktion diente die Hydroxylierung von sechs Steroiden mit ruhenden E. coli-Zellen, welche die P450 Monooxygenase CYP154C5 aus Nocardia farcinica und die Elektronentransferkomponenten Putidaredoxin (Pdx) und Putidaredoxinreduktase (PdR) aus Pseudomonas putida coexprimieren. Elicitine sind kleine, ungefähr 10 kDa große Steroltransporter, die von den Oomyceten Phytophthora und Phytium in ihre Umgebung sekretiert werden. Weil Elicitine heterolog bislang nur in Pichia pastoris exprimiert werden konnten, wurde zunächst die lösliche Expression von beta-Cinnamomin aus Phytophthora cinnamomi in E. coli etabliert. Zuerst wurde die cytoplasmatische Expression des Elicitins getestet, die jedoch aufgrund der drei konservierten Disulfidbrücken des beta-Cinnamomins fehlschlug. Um das Elicitin erfolgreich löslich zu exprimieren, wurde es daher mittels der Sec-abhängigen Sekretionssignalsequenz MalEss des Maltose Bindeproteins E ins Periplasma von E. coli exprimiert. Durch Fusion mit einem C-terminalen His-tag konnte das heterolog exprimierte Elicitin zudem durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie in einem einzigen chromatographischen Schritt mit hoher Reinheit aufgereinigt werden. Im Anschluss konnte auch die Expression eines weiteren Elicitins, beta-Cryptogein aus Phytophthora cryptogea, mit Erfolg unter denselben Bedingungen durchgeführt werden. Durch Zusatz des aufgereinigten beta-Cinnamomins in Ganzzellbiokatalysen der sechs Steroide Pregnenolon, Testosteron, Progesteron, Dehydroepiandrosteron, Androstendion und Nandrolon und durch Verwendung von Zellen, die beta-Cinnamomin zusammen mit CYP154C5, Pdx und PdR coexprimieren, in Ganzzellbiokatalysen konnte erfolgreich gezeigt werden, dass der Substratumsatz durch den Einsatz von beta-Cinnamomin signifikant verbessert werden kann.

Biocatalysis is a method to produce fine and bulk chemicals environmentally friendly by either using isolated enzymes or by using whole cells. In whole cell biocatalysis substrates are converted by (recombinant) microorganisms, expressing the enzymes intracellularly. A good conversion requires therefore the efficient uptake of the substrate molecules into the cells. However, especially big hydrophobic substrates often do not fulfill this requirement. Because of the composition of the cell wall of gram-negative bacteria hydrophobic molecules can enter the cells only with very slow diffusion rates. Hence, organic solvents, detergents, surfactants and cyclodextrins are applied to improve the solubility of hydrophobic substrates and to increase the permeability of the cell walls. Unfortunately, these additives are either very expensive or can lead to the destabilization of the cell wall. To avoid these problems, the improvement of the substrate conversion was tested in this work by applying elicitins in whole cell biocatalysis reactions. As model reaction served the hydroxylation of six steroids with resting E. coli cells, coexpressing the P450 monooxygenase from CYP154C5 Nocardia farcinica and the electron transfer components putidaredoxin (Pdx) and Putidaredoxinreduktase (PdR) from Pseudomonas putida. Elicitins are small 10 kDa sterol carrier proteins, which are secreted by the Oomycetes Phytophthora and Pythium into their surroundings. Since elicitins could be heterologously expressed solubly only in Pichia pastoris so far, initially the expression of beta-cinnamomin from Phytophthora cinnamomi had to be established in E. coli. First, the cytoplasmic expression of the elicitin was tested, which, however, resulted in the formation of insoluble inclusion bodies because of the three disulfide bonds of beta-cinnamomin. To express the elicitin solubly, it was therefore expressed into the periplasm of E. coli with the Sec-dependent secretion signal sequence MalEss of the maltose binding protein E. By cloning the gene of beta-cinnamomin in frame with a C-terminal His-tag, the heterologously expressed elicitin could be purified by immobilized metal ion affinity chromatography in a single chromatographic step with high purity. Following, the expression of another elicitin, beta-cryptogein from Phytophthora cryptogea, could be carried out successfully under the same conditions. In the second part of this work it could be shown, that the substrate conversion of whole cell biotransformations of the six steroids pregnenolone, testosterone, progesterone, dehydro¬epiandrosterone, androstendione and nandro¬lone, could be significantly improved by adding purified elicitin in the whole cell biocatalysis reactions and by using E. coli cells, coexpressing beta-cinnamomin with CYP154C5, Pdx and PdR, in the whole cell biotransformations.

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