Development of a protoplast based transformation system for genetic engineering of oil palm

Mat Yunus, Abdul Masani; Fischer, Rainer

doi:32621

Development of a protoplast based transformation system for genetic engineering of oil palm = Entwicklung eines Protoplasten-basierten Transformationssystems für gentechnische Modifikationen in Ölpalmen

Mat Yunus, Abdul Masani (Author)

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Abdul Masani Mat Yunus

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangXIII, 101 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-07-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-46724
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/229135/files/4672.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ölpalme (Genormte SW) ; Flüssigkultur (Genormte SW) ; Protoplast (Genormte SW) ; Pflanzen (Genormte SW) ; Regeneration (Genormte SW) ; Transgene Pflanzen (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Pflanzenregeneration (frei) ; oil palm (frei) ; suspension cultures (frei) ; protoplasts (frei) ; plant regeneration (frei) ; transgenic plants (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegt auf der Entwicklung grundlegender Techniken für gentechnisches Arbeiten mit Ölpalmen durch DNA Mikroinjektion. Mit Hilfe dieser Methode könnten zukünftig rekombinante Proteine wie PIPP (einem chimären Antikörper gegen das humane Chorionogonadotropin; hCG), D12 (einem human Antikörper gegen Karies) und HSA (Humanalbumin Serum) in den Blättern oder im Mesokarp und den Kernen transgener Ölpalmen synthetisiert werden. Idealerweise sollten die transgenen Pflanzen stabile Transformanten darstellen, die über keine selektierbaren Marker mehr verfügen. Dies soll durch den Einsatz von Expressions-Konstrukten erreicht werden, die die heterologen PIPP, D12 und HSA Gene unter der Kontrolle des LSP, MSP oder KSP Promotors exprimieren. Die entsprechenden Konstrukte wurden generiert und in Tabak auf Ihre Funktionalität getestet. Um mit Hilfe der DNA Mikroinjektion aus Ölpalmen Protoplasten stabile transgene Pflanzen zu generieren, ist die Regeneration der Gesamtpflanze aus Protoplasten obligat. Dazu wurde ein überarbeitetes Protokoll für die effiziente Protoplasten-Isolation aus Ölpalmen Flüssigkulturen etabliert. Basierend auf dieser optimierten Methode konnte zum ersten Mal Gesamtpflanzen aus Ölpalmen Protoplasten regeneriert werden; 14-17 Monate nach erfolgter Isolation wurden somit Pflanzen erfolgreich durch den Einsatz von Agarose Bead Kulturen regeneriert. Somit sind zukünftig sowohl die transiente Genexpression heterologer Gene in Protoplasten durch PEG-vermittelte Transformationsmethoden, als auch die Vermittlung einer stabilen Gen-Expression heterologer Gene mit Hilfe von DNA Mikroinjektion möglich. Um eine möglichst effiziente und zuverlässige PEG-vermittelte Transformationsmethode von Ölpalmen Protoplasten zu entwickeln, wurde der Einfluss der verschiedensten Parametern, wie z.B. dem Hitze-Schock, der Menge eingesetzter DNA, die PEG und MgCl2 Konzentration und der Transfektionsmethodik der Protoplasten analysiert und optimiert. Darüberhinaus war es im Verlauf dieser Arbeit möglich, innerhalb von 6 Monaten transgene Ölpalmen Mikrocalli durch DNA Mikroinjektion aus Protoplasten zu generieren. Weitergehende Resultate hierzu sind zu erwarten, sobald kleine Pflänzchen regeniert sind und analysiert werden können.

The major aim of the thesis was to develop the prerequisites for efficient genetic engineering of oil palm by DNA microinjection with the long-term objective to generate transgenic oil palm producing recombinant proteins, PIPP (a chimeric antibody against human chorionic gonadotropin; hCG), D12 (a human antibody against dental carries) and HSA (human serum albumin). The products will be synthesized in the leaf, mesocarp and kernel tissues of oil palm with the respects of plants must be stable and free from selectable marker. To achieve this, the constructs of PIPP, D12 and HSA genes, which were driven either by the promoter of LSP, MSP or KSP were successful constructed and their functionality was demonstrated in tobacco plants. To implement the oil palm protoplasts as starting material for the development of stable transgenic oil palms via DNA microinjection, the regeneration of true plants from protoplasts is a mandatory. Therefore, an improved protocol for the efficient isolation of high-quality protoplasts from oil palm suspension cultures was established. Subsequently, for the first time true oil palms were successfully regenerated from oil palm protoplasts by using optimal parameters. Nearly 14-17 months after protoplasts were isolated; true plants were generated using agarose bead culture. Following the success in regeneration of plants from protoplasts, the objective of this project became clearly to be achieved in the future when the protoplasts were used for PEG-mediated transient gene expression, and further used in the stable gene expression via DNA microinjection. The efficient and reliable protocol for PEG mediated transformation of oil palm protoplasts was developed by determing and validating the optimal parameters like heat shock treatment, the amount of DNA, PEG and magnesium chloride concentrations, and the procedure to transfect the protoplasts. As the main objective of this study, the transgenic microcalli of oil palm were successful generated from protoplasts transformed by DNA microinjection within 6 months. More conclusive results will be obtained when small plantlets are produced and analyzed.

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