Ganzzellbiotransformationen mit rekombinanten Escherichia coli zur Synthese chiraler Alkohole

Schroer, Kirsten; Wandrey, Christian

doi:2385

Ganzzellbiotransformationen mit rekombinanten Escherichia coli zur Synthese chiraler Alkohole = Whole cell biotransformation processes with recombinant Escherichia coli for the synthesis of chiral alcohols

Schroer, Kirsten (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kirsten Schroer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangXVI, 115 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Zusammenfassung in engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wandrey, Christian (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-05-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-23851
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/50104/files/Schroer_Kirsten.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biotransformation (Genormte SW) ; Chirale Verbindungen (Genormte SW) ; Escherichia coli (Genormte SW) ; Membran (Genormte SW) ; Cofaktor (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Ganzzell-Biotransformation (frei) ; Cofaktor-Regenerierung (frei) ; Membranrückhaltung (frei) ; Acetonabtrennung (frei) ; Metabolom-Analyse (frei) ; whole cell biotransformation (frei) ; cofactor regeneration (frei) ; membrane retention (frei) ; acetone removal (frei) ; metabolome analysis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ganzzellbiotransformations-Prozesse sind für die Synthese chiraler Substanzen von besonderem Interesse, da Mikroorganismen im Vergleich zu chemischen Katalysatoren und auch zu isolierten Enzymen einige Vorteile aufweisen. Aufgrund der intrazellulär vorhandenen Cofaktoren können Ganzzellbiotransformations-Prozesse ohne die Zugabe externer Cofaktoren auskommen. In dieser Arbeit wurden rekombinante Escherichia coli-Zellen als Katalysatoren für die Reduktion von Ketonen verwendet. Durch die Expression geeigneter Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) können beide Enantiomere eines chiralen Alkohols synthetisiert werden. Die Synthesen von enantiomerenreinem (R)-3-Hydroxybutyrat und (S)-3-Hydroxybutyrat wurden in kontinuierlichen Biotransformationsprozessen mit Membran-Rückhaltung der Biokatalysatoren durchgeführt. Rekombinante E. coli-Zellen, die eine ADH aus Lactobacillus brevis exprimieren, zeigten eine besonders hohe Stabilität während des Biotransformations-Prozesses, sogar bei Verwendung extrem hoher Substrat- und Cosubstrat-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu wurden Ganzell-Biokatalysatoren in Prozessen mit enzymgekoppelter Cofaktor-Regenerierung weitaus stärker geschädigt. Für den substratgekoppelten Ansatz zur Cofaktor-Regenerierung wurden Methoden der in situ-Acetonabtrennung untersucht. Es wurden Stripping, Pervaporation und die Extraktion mit einer ionischen Flüssigkeit als Strategien der in situ-Acetonabtrennung angewandt. In allen Fällen wurde durch die Überwindung der thermodynamischen und kinetischen Limitierung ein höherer Umsatz erzielt. Die Pervaporation stellte sich dabei als die für die Ganzzell-Biokatalysatoren schonendste Methode heraus mit nur geringfügiger Schädigung der Biokatalysatoren. Die Acetonabtrennung mittels Pervaporation wurde daraufhin auch in kontinuierlich betriebenen Biotransformationsprozessen verwendet. Für das Verständnis von Ganzzell-Biokatalysatoren ist es wünschenswert, die intrazellulären Cofaktor-Konzentrationen während eines Biotransformations-Prozesses verfolgen zu können. Eine neuartige Methode zur Bestimmung verschiedener intrazellulärer Metabolite wurde auf Biotransformations-Prozesse mit rekombinanten E. coli übertragen und angewandt. Es wurden die intrazellulären Konzentrationen der Cofaktoren während der Reduktion von Methylacetoacetat und 2,5-Hexandion mit substratgekoppelter Cofaktor-Regenerierung durch Oxidation von 2-Propanol bestimmt.

Whole cell biotransformation processes are of special interest for the synthesis of chiral compounds since microorganisms offer some advantages in comparison to chemical catalysts or even isolated enzymes. Due to their internal production of cofactors biotransformation processes using whole cell catalysts can be operated without addition of external cofactors. In this study recombinant Escherichia coli cells were applied as biocatalysts for the reduction of ketones. By the expression of suitable alcohol dehydrogenases (adh) both enantiomeres of chiral alcohols can be produced. The syntheses of enantiopure (R)-3-hydroxybutyrate and (S)-3-hydroxybutyrate were carried out in continuously operated biotransformation processes with membrane retention of the whole cell biocatalysts. Recombinant E. coli expressing adh from Lactobacillus brevis turned out to be stable during biotransformation processes with substrate-coupled cofactor regeneration even when exceedingly high concentration of substrate and cosubstrate were applied. In contrast to that processes with enzyme-coupled cofactor regeneration affects the biocatalyst stability more intensely. For the substrate-coupled approach further investigations deal with the application of in situ acetone removal techniques in whole cell transformation processes. Stripping, pervaporation and extraction with an ionic liquid were applied as strategies for in situ acetone removal. In all cases higher conversion was achieved by overcoming thermodynamic and kinetic limitations. The pervaporation procedure turned out to be the most gentle method of acetone removal which only causes negligible damage to the whole cell biocatalysts. It was also applied for continuously operated biotransformation processes. For the knowledge of whole cell biocatalysts it is desirable to quantify intracellular concentrations of cofactors during a biotransformation process. A new method for quantification of several intracellular metabolites was developed and now transferred to biotransformation processes with recombinant E. coli. The concentrations of intracellular cofactor concentrations were determined during the reduction of methyl acetoacetate and 2,5-hexanedione with substrate-coupled cofactor regeneration by oxidation of 2-propanol.

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