Neue Anwendungen von (S)-Adenosyl-L-methionin-Analoga mit Protein-Methyltransferasen und Click-Chemie zur sequenzspezifischen Markierung von Proteinen

Peters, Wibke; Weinhold, Elmar

doi:2860

Neue Anwendungen von (S)-Adenosyl-L-methionin-Analoga mit Protein-Methyltransferasen und Click-Chemie zur sequenzspezifischen Markierung von Proteinen = Neue Anwendungen von (S)-Adenosyl-L-methionin-Analoga mit Protein-Methyltransferasen und Click-Chemie zur sequenzspezifischen Markierung von Proteinen

Peters, Wibke (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Wibke Peters

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangVII, 115 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-04-21

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-28603
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/51282/files/Peters_Wibke.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Methyltransferasen (Genormte SW) ; Cofaktor (Genormte SW) ; Histone (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; protein methyltransferases (frei) ; cofactor (frei) ; histone code (frei) ; click-chemistry (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die posttranslationale Methylierung von Proteinen übt wichtige regulatorische Funktionen aus. Besonders im Zusammenhang mit dem Histon-Code sind Histon-Methylierungen an Arginin- und Lysin-Resten und ihre Funktion in der Kontrolle der Genexpression verstärkt untersucht worden. In biologischen Methylierungsreaktionen dient der ubiquitäre Cofaktor S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) als Methylgruppendonor. Die Methylierung von Zielpositionen erfolgt katalysiert von Protein-Methyltransferasen (MTasen). Leider ist die Methylgruppe ein schlechter chemischer Reporter und damit schlecht zu analysieren. Um größere chemische funktionelle Gruppen statt der Methylgruppe auf die Zielsubstrate übertragen zu können, wurden synthetische AdoMet-Analoga hergestellt, die schon zur sequenzspezifischen Modifikation von DNA mittels DNA-MTasen eingesetzt werden konnten. Die Analoga tragen statt der Methylgruppe eine verlängerte, aktivierte Seitenkette, die von MTasen auf spezifischen Erkennungssequenzen übertragen werden kann. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der synthetischen Cofaktor-Analoga ein zweistufiges sequenzspezifisches Markierungssystem für Proteine erarbeitet. Die synthetischen AdoMet-Analoga sollten zur Modifikation von Proteinen durch Protein-MTasen eingesetzt werden. In einer nachfolgenden chemischen Reaktion sollten dann Reporter an die funktionelle Gruppe kovalent gebunden werden. Die aus dem Pilz Neurospora crassa stammende Histon H3K9-spezifische Protein-MTase Dim-5 wurde für erste Untersuchungen mit syntheti-schen Cofaktoren ausgewählt. Als Substrat diente ein Fluorescein-markiertes Histon-Peptid das mittels rp-HPLC und Fluoreszenzdetektor einfach detektiert werden kann. Verlängerte Seiten-ketten der synthetischen Cofaktoren mit funktionellen Gruppen konnten von Dim-5 auf das Peptid übertragen werden. Ein neuer Cofaktor mit einem terminalen Alkin wurde speziell für den Einsatz in der nachfolgenden Click-Reaktion synthetisiert. Dim-5 überträgt die Seitenkette des AdoMet-Analogons AdoEnIn auf das Peptid. Dadurch wurde ein terminales Alkin enzym-katalysiert in das Substrat eingeführt. In einer Cu(I)-katalysierten Cycloaddition eines terminalen Alkins mit einem Azid, einer sogenannten Click-Reaktion, die bioorthogonalen Charakter hat und in vitro in biologischen Systemen eingesetzt werden kann, kann eine Azid-derivatisierte Reportergruppe mit dem Alkin-modifizierten Peptid gekuppelt werden. Als Reporter wurde Biotin eingesetzt. Nach dem Einstellen der Reaktionsbedingungen für die enzymatische Übertragung der Seitenkette und der chemischen Biotinylierung durch Click-Reaktion mit dem Histon-Peptid, sollte die zweistufige Markierungsreaktion auf vollständige Proteine angewandt werden. Histon H3 wurde von Dim-5 mit der AdoEnIn-Seitenkette modifiziert und durch Click-Reaktion mit Biotin-PEG-Azid biotinyliert. Zur Detektion des markierten Proteins wurde das Reaktionsgemisch durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Western-Blot mit Peroxidase-gekuppeltem Avidin detektiert. Das Cofaktor-Analogon AdoEnIn konnte auch von euka-ryotischen Protein-MTasen umgesetzt werden. Diese benötigen im Gegensatz zu prokaryotischen MTasen andere Proteine, mit denen sie in einem Komplex ihre MTase-Aktivität entfalten können. Ein ASH2-Proteinkomplex enthält MLL4, eine humane H3K4 Protein-MTase. Mit dem ASH2-Komplex und AdoEnIn konnte Histon H3 alkinyliert und durch die Click-Reaktion biotinyliert werden, was im Western-Blot mit dem oben beschriebenen Avidin-Konjugat nachgewiesen werden konnte. Auch ein C-terminales Fragment von MLL4, welches das katalytische Zentrum trägt, konnte nach Expression und Reinigung Histon H3 mit AdoEnIn modifizieren, nach der chemischen Biotinylierung konnte im Western-Blot ein starkes Signal detektiert werden. Die Enzymaktivitäten endogener Protein-MTasen in Zellextrakten wurden zur Übertragung der Seitenkette von AdoEnIn auf ihre spezifischen Substrate genutzt. Die Markierung mit Biotin erlaubt die Detektion der modifizierten Proteine im Western-Blot, außerdem konnten die biotinylierten Proteine aus dem Kernextrakt mittels magnetischer, Streptavidin-beschichteter Partikel isoliert und durch SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung sichtbar gemacht oder massenpektrometrisch analysiert werden.

Posttranslational protein methylation has been connected to important regulatory mechanisms in cells. Especially in context with the histone code, the methylation of arginin and lysine residues on histone proteins and their function in the regulation of gene expression has been studied in detail over the past years. The ubiquitous cofactor S-adenosyl-L-methionin (AdoMet) is the major methyl donor for enzymatic methylation reactions. Protein methyltransferases (MTases) catalyse methyl group transfer to target amino acid residues. However, the methyl group is a poor chemical reporter. To transfer larger functional groups than the methyl group to target positions, synthetic AdoMet analogues have been synthesized which have already been used with DNA-MTases for sequence-specific modification of DNA. The AdoMet analogues carry extended, activated side chains replacing the methyl group. With these synthetic cofactor analogues and protein MTases, a two-step labeling system for proteins was established in this work. Target proteins shall be modified by transferring the extended side chains carrying functional groups from synthetic AdoMet analogues with protein MTases. The functional groups are subsequently labeled in a bioorthogonal chemical reaction. The fungal histone lysine protein MTase Dim-5 is specific for H3K9 and was chosen for test reactions with the synthetic AdoMet analogues. A fluorescein-labeled histone peptide encompassing amino acids 1-15 from histone H3 served as a substrate. Extended side chains from synthetic AdoMet analogues could be transferred to the peptide by Dim-5. A new cofactor with a terminal alkyne as the functional group was synthesized particularly for the application in the chemical labeling reaction. The extended side chain of this AdoMet analogue AdoEnIn was transferred to the histone peptide by Dim-5. By transferring the extended side chain, a terminal alkyne was enzymatically introduced to the substrate peptide. An azide-derivatized reporter can be coupled with the alkinylated peptide in a Cu(I) catalyzed cycloaddition reaction, a so called ‘Click-Reaction’. This coupling reaction is of bioorthogonal character and can be applied to biological systems in vitro. Using the click reaction, the alkinylated peptide was biotinylated. After optimizing the reaction conditions for the enzymatic side chain transfer and the subsequent chemical biotinylation with the histone peptide, the modification-and-labeling system should be applied to full length proteins. Histone H3 was modified with the AdoEnIn side chain by Dim-5 and biotinylated via the click reaction. The reaction mixture was seperated by SDS-PAGE and detected by a Western-Blot using peroxidase-coupled avidin. The analogue AdoEnIn could also serve as a cofactor for eukaryotic protein MTases. In contrast to prokaryotic protein MTases, these are only active in protein complexes with several subunits. A human ASH2 complex contains MLL4, a H3K4 protein MTase. Histone H3 was alkinylated with AdoEnIn by the ASH2 complex and biotinylated via the click reaction. The biotinylated histone was detected by a western-blot using the peroxidase-avidin conjugate. A C-terminal fragment of MLL4 carrying the catalytic site was able to modify histone H3 with the AdoEnIn side chain, chemical biotinylation could be detected in a western-blot. The enzymatic activities of endogenous protein MTases in cell extracts were used for AdoEnIn side chain transfer to their specific substrates. Labeling with biotin allowed the detection of the modified proteins in western blots. In addition, the biotinylated proteins could either be isolated with streptavidin-coated magnetic beads and subsequently silver stained in SDS gels or were alternatively analyzed by mass spectrometry.

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