Funktionsbasierte Isolierung von Subproteomen mit trifunktionellen Fangverbindungen

Poot, Peter; Weinhold, Elmar

doi:3911

Funktionsbasierte Isolierung von Subproteomen mit trifunktionellen Fangverbindungen = Function-based isolation of sub-proteomes with trifunctional capture compounds™

Poot, Peter (Author)

2011 & 2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Peter Poot

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangIX, 196 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Prüfungsjahr: 2011. - Publikationsjahr: 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-02-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-39111
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/52346/files/3911.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Transferasen (Genormte SW) ; Methyltransferasen (Genormte SW) ; Adenosylmethionin (Genormte SW) ; Proteomanalyse (Genormte SW) ; LC-MS (Genormte SW) ; Proteine (Genormte SW) ; DNS-Methyltransferase (Genormte SW) ; Escherichia coli (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Methyltransferase (frei) ; Fangverbindung (frei) ; SAM (frei) ; SAH (frei) ; proteomics (frei) ; capture compound (frei) ; AdoMet (frei) ; AdoHcy (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Isolieren, Identifizieren und Quantifizieren funktioneller Subproteome durch die Verwendung trifunktioneller Fangverbindungen mit anschließender massenspektrometrischer Analyse ist eine relativ neue, vielversprechende Technik der Proteomik. Besonders für die Aufklärung der Wirkungen und Nebenwirkungen von Medikamenten oder Pflanzenschutzmitteln, sowie für die molekularbiologische Grundlagenforschung, birgt sie ein nicht zu unterschätzendes Potential. Als 2005 die erste photoaktivierbare Fangverbindung für Methyltransferasen an der RWTH Aachen zur Verfügung stand, war noch unklar, auf welche Weise diese eingesetzt werden muss, um zu massenspektrometrisch auswertbaren Proben zu gelangen. Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb das Ausarbeiten geeigneter Rahmenbedingungen für den Einsatz trifunktioneller Fangverbindungen. Dies sollte besonders das Austesten einer geeigneten Vorbehandlung des Probenmaterials, geeigneter Pufferbedingungen und effizienter Photoaktivierung, sowie die Maximierung der Ausbeute an spezifisch eingefangenen Proteinen und eine Minimierung unerwünschter Nebenreaktionen umfassen. Als zweites Ziel sollte die neue Technik am Modellorganismus E. coli erprobt werden, um damit einerseits den Nachweis ihrer Anwendbarkeit zu erbringen und außerdem ihre Möglichkeiten auszutesten. Die Isolierung des Methyloms, also der Gesamtheit aller Methyltransferasen dieses Organismus, stellte hierbei eine geeignete Herausforderung dar, da diese Proteine weder extrem gut an ihren Kofaktor binden, noch besonders stark expremiert werden. Das Resultat sollte anschließend mit den Ergebnissen anderer Techniken zur Proteomanalyse verglichen werden. Außerdem sollten auch eukaryontische Methyltransferasen aus pflanzlichen und tierischen Zelllysaten isoliert werden.

Isolation, identification and quantitation of functional subproteomes by use of trifunctional capture compounds™, followed by mass spectrometric analysis, is a relatively new, promising technology for proteomic research. Particularly for analysis of effects and side effects of drugs or plant protection agents, as well as for the molecular biological basic research, the capability of this technology could be immense. When in 2005 the first photoaktivable capture compound™ for methyltransferases was avaiable at Aachen University, it was still unclear how it should be implemented to obtain samples suitable to further mass spectrometric analysis. An important challenge during this work was therefore, working out suitable basic conditions. This included the checkout of a suitable pretreatment of test material, viable buffer terms and efficient photo activation, as well as the maximization of the yield in specific proteins and a minimization of non-specific proteins. As a second aim, the new technology should be tested with the model organism E. coli. This, at the one hand, was a good demonstration of her applicability and, at the other hand, posed a challenge in that many of the target proteins thitherto have never been isolated. Beyond that, these rare expressed target proteins do not show a high affinity towards their cofactor and the used capture compound™. E. colis “methylome” therefore was a fascinating test object to check out the new methods capabilities and enabled a fair comparison to other up to date techniques.

Fulltext:
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