Identifizierung und Untersuchung eines Magnesium-Transportproteins in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Hammelmann, Silke; Wolf, Klaus

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-14851

Identifizierung und Untersuchung eines Magnesium-Transportproteins in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Hammelmann, Silke (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Silke Hammelmann

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangVI, 133 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wolf, Klaus (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-10-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-14851
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/60969/files/Hammelmann_Silke.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Schizosaccharomyces pombe (frei) ; Transportprotein (frei) ; Magnesium (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In dieser Arbeit wurde das Protein VMU1p von Schizosaccharomyces pombe untersucht.Dabei handelt es sich um ein Magnesium-Transportprotein, welches, laut Datenbank, zwei Transmembran-Domänen besitzt. Es wurde unter dem ORF O13779 aus der SWISS PROT Datenbank ausgesucht, da es eine ähnliche Struktur wie die CorA-Proteine in Bakterien besitzt und eine hohe Ähnlichkeit mit Schwermetall-Resistenzproteinen aufweist. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von VMU1p mit der von E. coli CorA-Protein und ARL1p, ARL2p und MRS2p aus S. cerevisiae zeigen, dass zwischen dem Protein aus S. pombe und den anderen Magnesium-Transportern unterschiedliche Übereinstimmungen herrschen. Mit ARL1p und ARL2p stimmt es zu 35% und mit den anderen beiden zu 6% überein. Eine gezielte Disruption des Gens im haploiden Stamm D18h- führte nicht zumErfolg. PCR- und Southernblot-Analsysen zeigten, dass in einer Zelle sowohl der Wildtyp-Leserahmen wie auch die Disruptionskassette vorlag. Die Hefe diploidisierte. Dies ließ daraufschließen, dass dieser Genabschnitt sehr wichtig für die Hefe ist und Veränderungen, wie dieDisruption des ORFs O13779 ein sehr negatives Ereignis darstellt. Dieselbe Disruption imdiploiden Stamm 130x131 war erfolgreich, was PCR- und Southernblot-Analysen belegten.Die darauf folgende Tetradenanalyse zeigte eine 2+:2- Aufspaltung des his3-Markers. Das Protein VMU1p ist somit nicht essentiell. Unter normalen Wachstumsbedingungen verhielten sich die Disruptanten wie der Wildtyp und zeigten die gleiche Wachstumsrate. Zellen, welche in magnesiumfreies Medium überführt wurden, stellten ihr Wachstum ein, wohingegenWildtypzellen noch einige Zeit weiterwuchsen. Wurde nach kurzer Zeit wieder Magnesiumzum Medium gegeben, wuchsen alle Stämme normal weiter. Dies lässt darauf schließen, dasdie Aufnahme von Magnesium in die Zelle funktioniert, nicht aber die Remobilisierung ausSpeichern, wie zum Beispiel der Vakuole.Des weiteren kosegregierte der his3-Marker mit einer erhöhten Zinksensitivität. EineResistenz gegen Kobalt oder Aluminium, wie bei ARL1p und ARL2p wurde hingegen nichtbeobachtet. Dies könnte ein Indiz gegen eine Lokalisation in der Plasmamembran sein.Die Komplementationsversuche waren sehr erfolgreich und belegten, dass der beschriebenePhänotyp auf eine Disruption des ORFs O13779 zurück zuführen ist.Lokalisationsstudien von VMU1p wurden mit zahlreichen Plasmiden, die sowohl GFP-, wieauch Ha-Markierungen besaßen, durchgeführt. Diese Studien lassen darauf schließen, dassVMU1p in der Vakuolenmembran lokalisiert ist. Allerdings konnte an dieser Stelle keineganz genauen Aussagen über die Lokalisation getroffen werden, da Fremd-DNA meist sofort.

The protein VMU1p (Vacuolar magnesium utilization) is a member of the MIT family (metal ion transporter) and has domains homologous to CorA-like Mg2+ transport proteins. This protein is encoded by Schizosaccharomyces pombe reading frame O13779. VMU1p contains the highly conserved motive GMN, which was found in all known magnesium transport proteins. These results support the idea that VMLU1p is a magnesium transporter.In order to identify the function of VMU1p, the vmu gen of the diploid S. pombe strain 130x131 was disrupted. The correct integration was controlled by PCR and Southern blotting. The tetrad analyses demonstrated a 2+:2- segregation of the his3 selection marker. This shows that VMU1p is not essential. Under normal grow conditions the disruptant and the wildtype strains showed similar growth rates. If the cells grew in medium without magnesium, the disrupted strains stopped growing earlier compared to the wildtype. The addition of magnesium restored growth. A magnesium specific staining showed that magnesium remained in the vacuoles in the disruptant strain but not in the wild type. These study suggests that magnesium transport into the cell takes place both in the disrupted and the wildtype strain, but magnesium mobilisation out of the vacuole within the cell is affected in the disruptant.Transformation of the disruptant with the VMU1 reading frame complemented the phenotype.Expression of a VMU1p-GFP fusion protein in S. pombe showed that VMU1p is localized in the vacuole membrane.

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