Identifizierung von Cyclin L2 und des Spleißfaktors SF3B1 als Substrate der Proteinkinase DYRK1A

de Graaf, Katrin; Becker, Walter

doi:793

Identifizierung von Cyclin L2 und des Spleißfaktors SF3B1 als Substrate der Proteinkinase DYRK1A

de Graaf, Katrin (Author)

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Katrin de Graaf

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangIV, 120 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Becker, Walter (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-02-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-7935
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-123590
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/61989/files/61989.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteinkinasen (Genormte SW) ; Cyclin-abhängige Kinasen (Genormte SW) ; Enzymsubstrat (Genormte SW) ; Cycline (Genormte SW) ; Spleißfaktor (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; DYRK1A (frei) ; SF3B1 (frei) ; Cyclin L2 (frei) ; Spleißen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Der Proteinkinase DYRK1A wird eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems zugesprochen. Bislang ist allerdings nicht hinreichend bekannt, wie die Funktion von DYRK1A auf molekularer Ebene vermittelt wird. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Substraten, um Erkenntnisse über die zellulären Funktionen der Kinase zu gewinnen. Durch die Phosphorylierung von Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek mit DYRK1A konnten acht in vitro-Substrate identifiziert werden. Zwei der identifizierten Substrate, Cyclin L2 und SF3B1, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Cyclin L2, ein bislang nicht näher beschriebenes Protein, besitzt die interessante Kombination einer Cyclindomäne und einer Arginin-Serin-reichen (RS)-Domäne und wurde in dieser Arbeit ausführlich charakterisiert. Es wurden alternative Transkripte identifiziert und deren Expression in verschiedenen Geweben untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die RS-Domäne von Cyclin L2 eine Interaktion mit dem Spleißfaktor ASF und die Lokalisation in Nuclear Speckles vermittelt, die als Aufbewahrungsorte für Spleißfaktoren gelten. Durch die Herstellung eines spezifischen Antikörpers konnte Cyclin L2 in Maushoden nachgewiesen werden. DYRK1A kann Cyclin L2 sowohl in vitro als auch in COS-7 Zellen phosphorylieren. SF3B1 ist zentraler Bestandteil des Spleißosoms und wird während des Spleißprozesses phosphoryliert. Als mögliche verantwortliche Kinase gilt CDK2 in Kombination mit der regulatorischen Untereinheit Cyclin E. In dieser Arbeit wurde SF3B1 durch kinetische Analysen als ein hoch affines in vitro-Substrat der Kinasen DYRK1A und CDK2/Cyclin E nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen aber, dass ein Großteil der Phosphorylierung in COS-7 Zellen nicht durch CDK2, sondern durch DYRK1A katalysiert wird. Somit ist DYRK1A ein aussichtsreicher Kandidat für die regulatorische Phosphorylierung von SF3B1 bei Spleißprozessen. Die hier identifizierten Substrate weisen auf eine regulatorische Funktion von DYRK1A in Spleißprozessen hin.

The protein kinase DYRK1A is supposed to play an important role in the development of the central nervous system. However the exact role of the kinase in the cell is largely unknown. It was the aim of this study to identify substrates to get insights about the cellular function of the kinase. By phosphorylation of the proteins of a cDNA expression library with DYRK1A, eight in vitro substrates were identified. Two of them, cyclin L2 and SF3B1, were chosen for further investigations. Cyclin L2 combines a cyclin domain with an arginine-serine-rich (RS)-domain and was extensively characterised in this work. Alternatively spliced transcripts were identified and their expression in different tissues was analysed. The results demonstrate that the RS-domain of cyclin L2 is responsible for the interaction with the splicing factor ASF2 and the localisation in nuclear speckles, which are supposed to be storage compartments of splicing factors. By the production of a specific antibody, the protein could be detected in mouse testis. DYRK1A phosphorylates cyclin L2 both in vitro and in COS-7 cells. SF3B1 is a central component of the splicosome and is phosphorylated during the splicing process. CDK2 in combination with the regulatory subunit cyclin E has been proposed as a candidate responsible for this phosphorylation. Kinetic analysis demonstrates that SF3B1 is a high affinity in vitro substrate of both DYRK1A and CDK2/CyclinE. But the data obtained in this work suggest that the main part of the phosphorylation in COS-7 cells is catalysed by DYRK1A and not CDK2. Thus, DYRK1A is a promising candidate for the regulatory phosphorylation described in the literature. The substrates identified in this work suggest a regulatory function of DYRK1A in splicing processes.

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