Production of recombinant human serum albumin in transgenic plants and plant cells

Mavituna, Ayse Meltem; Fischer, Rainer

doi:1193

Production of recombinant human serum albumin in transgenic plants and plant cells

Mavituna, Ayse Meltem (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von A. Meltem Mavituna

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangIII, 143 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-05-30

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-11932
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/62135/files/Mavituna_Meltem.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; Human Serum Albumin (frei) ; molecular farming (frei) ; trangenic (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Menschliches Serumalbumin (Human Serum Albumin, HSA) ist das meist verbreitete Protein im menschlichen Kreislauf. Die Hauptfunktion von HSA ist der Transport von Fettsäuren, aber es ist auch im Stande eine Vielzahl von unterschiedlichen Metaboliten und Arzneimitteln zu binden. HSA wird als Plasmaexpander, stabilisierendes und transportierendes Agens für Proteine und Arzneimittel verwendet. Außerdem verlängert es bei Zusatz zu Insulin dessen Wirkung. Diese Eigenschaften führen zu einem gesteigerten Bedarf an reinem HSA. Zurzeit wird HSA konventionell aus Blutkonserven von Blutspendern gewonnen. Dieses Verfahren ist anfällig für Verunreinigungen durch pathogene Viren und Proteine wie z. B. Prionen, die die verschiedensten Krankheiten auslösen können. Der jährliche Bedarf an HSA beläuft sich auf mehr als 500 Tonnen mit einem Markwert von mehr als 1,5 Billionen US(Fernandez−SanMillanetal.2003). Unter Berücksichtigung der Menge an Plasmaexpandern die für die Versorgung schwerkranker Patienten notwendig ist, stellt die Verwendung von Albumin einen hohen Kostenfaktor dar (Nicholsonetal.2000). Eine solch hohe Nachfrage an HSA kann nicht allein durch Blutkonserven gedeckt werden, da sie den limitierenden Faktor darstellen. Alternative Wege zur HSA Gewinnung sind besonders attraktiv, da sie von Blutbanken unabhängig sind und die Gesundheitsgefährdung durch Infektionskrankheiten wie z.B. AIDS und Hepatitis aus kontaminiertem Blut ausschließen. Daher war der erste Ansatz dieser Arbeit, ein neues für Pflanzen Codons optimiertes semi−syntetischesHSA−Gen durch PCR Amplifikation zu generieren. Die Strategie basiert auf den Austausch von in Pflanzen selten genutzten Codons zugunsten der geeigneten pflanzlichen Codons, die eine optimale Expression des rekombinanten HSAs(rHSA) ermöglichen. Die Sequenzanalysen des Codon optimierten HSAs, zeigten hohe Mutationen im Endprodukt mit Insertionen und Deletionen von mehreren Basen, die nicht eliminiert werden konnten. Das Hauptziel dieser Arbeit war es ein alternatives Expressionssystem für die Produktion der authentische nHSAc DNA zu etablieren. Weitere Analysen beinhalten die Expression und die Charakterisierung des rHSAinE.coli, die transiente Expression in Tabak−, Zucchini−und Bohnenblättern, sowie eine stabile Expression in Tabak−, Weizenpflanzen und in Tabaksuspensionskulturen. Zur Expression des rHSA in Bakterien wurden Vektoren hergestellt die eine Expression sowohl im periplasmatischen als auch im cytoplasmatischen Raum ermöglichen. Nach Bestätigung der Expression in E.coli wurde das rekombinante Protein gereinigt. Außerdem wurde die Expression in Tabak, Zucchini und Bohnen untersucht. Die transienten Expression des rHSA im Apoplasten als auch die im Endoplasmatischen Retikulum(ER) zeigte keine Unterschiede. In weiterführenden Analysen wurden mit Agrobakterium stabile Transformationen an Tabakpflanzen durchgeführt. Die Akkumulation des rHSA im ER und die Sekretion in den Apoplasten wurden mit der Imunoblot−Analyse verifiziert. Parallel zu den Expressionsstudien in intakten Zellen erfolgte die Anzucht von Tabaksuspensionkulturen. Dabei konnte sowohl das intrazellulär angereicherte als auch das sekretorisch produzierte Protein in transgenen BY2Batch−Kulturen detektiert werden. Durch den Zusatz geeigneter Agentien (Stabilisatoren) zum Wachstumsmedium, konnte das Protein nach Sekretion stabilisiert werden. Die Ergebnisse aus den Expressionsstudien und den verwendeten Expressionssystemen wurden in der vorliegenden Arbeit diskutiert. Abschließend wurde die Weiterverarbeitung des rHSA aus transgenenTabakblättern untersucht. Die Bedingungen für die effiziente Extraktion des rekombinanten Proteins aus dem Pflanzensystem wurden optimiert und das rHSA partiell über Kationenaustausch Chromatographie gereinigt.

Humanserumalbumin(HSA)is the most abundant protein in the circulatory system. The principal function of HAS is to transport fatty acids, but it is also capable of binding agreat variety of metabolites and drugs. The potential of HAS in various applications, like usage as a plasma expander, stabilizing agent, drug delivery protein and as an adjunct in insulin action prolongation demands agreat supply of pure HSA. Presently HAS is manufactured from the blood pooled from commercial blood donors. There is no guarantee regarding contamination of the product by viral pathogens and prions, causing dreadful diseases. The annual world need exceeds 500tons, representing a market value of more than 1.5 billion US (Fernandez-San Millan et al. 2003). Considering the amount of plasma expanders required in critically ill patients, the use of albumin represents a significant cost (Nicholson et al. 2000). Such a huge demand can not longer be met by merely purifying HSA from original sources, as the supply of human blood is limited. Alternative ways to obtain HSA are highly attractive both to decrease the dependence on blood banks and to reduce possible health hazards, such as AIDS and hepatitis that may be transmitted during/by infusion of products derived of contaminated blood. The initial attempt was to generate a novel plant codon optimised semi-synthetic HSA gene by PCR amplification. The strategy was to eliminate the rare codons that are used at low frequencies in the plant host system resulting in an optimized codon usage pattern for high-level expression of recombinant HSA (rHSA). Sequence analysis revealed the presence of high number mutations in the final product, including insertions and deletions of several bases which could not be eliminated. The main focus of the work was to establish an alternative expression system for the production of the authentic HSA cDNA. Further analysis included expression and characterization of rHSA in E. coli, transient expression in leaves of tobacco, zucchini and bean, stable expression in (intact) tobacco and wheat plants and tobacco cell suspension culture. For bacterial expression of rHSA, cytoplasmic and periplasmic expression vectors were generated. After verifying expression in E. coli, purification of the recombinant protein was carried out. Tobacco, zucchini and bean host systems were assessed for expression of rHSA. No difference in transient accumulation levels were observed when the protein was either secreted to the apoplast or targeted to endoplasmic reticulum (ER). Further analysis included stable transformation of tobacco plants via Agrobacterium mediated gene transfer. Accumulation of rHSA in the ER and secretion into the apoplast were confirmed by immunoblot analysis. In parallel to the expression studies in intact plants, tobacco suspension cultures were initiated and both intracellular and secreted protein could be detected in batch culture of the transgenic BY2 cells. Protein stability following secretion could be improved with the addition of appropriate chemical agents (stabilizers) to the growth media. The results achieved by all expression systems and their comparison were performed. Finally downstream processing of the rHSA from transgenic tobacco leaves was investigated. Conditions for an efficient extraction of the recombinant protein from plant system were optimised and cation exchange chromatography to partially purify rHSA was carried out.

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