Engineering and characterization of single chain antibody fragments (scFvs) specific to key enzymes in polyamine biosynthesis and manipulation of polyamine pathway by constitutive expression of recombinant ODC and SDE enzymes in transgenic tobacco

Nölke, Greta; Fischer, Rainer

doi:434

Engineering and characterization of single chain antibody fragments (scFvs) specific to key enzymes in polyamine biosynthesis and manipulation of polyamine pathway by constitutive expression of recombinant ODC and SDE enzymes in transgenic tobacco

Nölke, Greta (Author)

2002

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Greta Nölke

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2002

UmfangV, 156, 7 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2002

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2002-09-20

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-4340
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/62243/files/Noelke_Greta.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; polyamine manipulation (frei) ; scFvs (frei) ; transgenic plants (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Polyamine stellen eine Gruppe natürlicher Verbindungen dar, die in allen Organismen vorkommen und dort in einer Vielzahl biologischer Prozesse involviert sind. Hierzu zählen nicht nur das Zellwachstum und Differenzierungsprozesse, sondern auch der programmierte Zelltod. Je nach Konzentration der drei häufigsten Polyamine Putrescin, Spermidin und Spermin in verschiedenen Nahrungsmitteln besteht auch eine Korrelation zur Ausprägung diverser Tumorkrankheiten. Aus diesem Grunde ist es wichtig, die Konzentration dieser Polyamine in Nahrungsmitteln zu regulieren und in eine bioverfügbare Form zu bringen, um ein positiven ernährungsphysiologischen Effekt zu erzielen. Hierzu gibt es diverse Möglichkeiten. So kann man die in der Polyaminbiosynthese involvierten Schlüsselenzyme wie z.B. die Ornithin-Decaboxylase (ODC) und Spermidin-Synthase (SDE) überexpremieren oder diese durch Immunomodulation mit Hilfe spezifischer Antikörper stabilisieren oder inhibieren. Die Immunomodulation ist ein innovativer und neuer Ansatz, der im Gegensatz zur Antisense-Strategie eine Regulation auf Proteinebene ermöglicht und somit Phänomene des Gene-silencings umgehen kann und in Abhängigkeit der Expressionsstärke der Antikörper unterschiedliche Modulationsgrade erlaubt. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Ansätze verfolgt, um die Konzentration der Polyamine in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen zu regulieren, bevor dieses Konzept auf wichtige Nahrungspflanzen wie Reis und Weizen zur Verbesserung der ernährungsphysiologischen Eigenschaften eingesetzt werden sollte: 1) Veränderung der Polyaminbiosynthese mit Hilfe gentechnischer Überexpression von heterologen cDNAs (humane ODC cDNA sowie eine chimäre Maus-Mensch SDE) und deren Targeting in unterschiedliche Kompartimente der Pflanzenzelle. 2) Generierung von rekombinanten Antikörpern gegen drei ausgewählte Schlüsselenzyme der Polyaminbiosynthese und deren heterologe Expression in gentechnisch veränderten Tabakpflanzen. ODC wurde aus einer humanen cDNA Bank amplifiziert und in einen Pflanzenvektor in drei Varianten zum Targeting rekombinanter ODC in das Cytosol, den Apolplasten und das ER kloniert. T2 Generationen transgener Pflanzenlinien, die ODC im Apoplasten exprimieren, zeigten eine um den Faktor 32 erhöhte ODC Aktivität und 5-fach erhöhte Putrescinmengen. Zusätzlich wurden doppelt transgene Linien durch Kreuzung transgener Pflanzenlinien, die ODC im Apoplasten exprimierten, mit Linien, die die chimäre SDE im Apoplasten exprimierten, hergestellt. Mit Hilfe von Immunoblotanalysen konnten Linien identifiziert werden, die beide Enzyme ko-exprimierten, was in ~5fach erhöhten Putrescin- und Spermidin-Konzentrationen resultierte. Erhöhte Sperminwerte wurden nicht festgestellt. Die Schlüsselenzyme ADC, ODC und PAO wurden als Targets für die Herstellung von spezifischen Antikörperfragmenten mittels der Phage Display Technologie ausgewählt. Dazu wurden die ADC, GST-ODC und GST-PAO Targetproteinen kloniert und in E.coli produziert und Mäuse mit den rekombinanten ADC, GST-ODC und GST-PAO Targetproteinen immunisiert. Nach Bestimmung der Antikörpertiter aus den Mäuse-Seren wurde die Gesamt-RNS und mRNS aus Milzzellen isoliert, cDNS synthetisiert, die VH- und VL-Domänen amplifiziert und über die eingefügten Restriktionschnittstellen zu drei scFv Bibliotheken zusammengefügt. ADC- und ODC-spezifische scFvs wurden mit Hilfe einer Festphasenmethode aus den scFv Phagendisplay-Bibliotheken angereichert und detailliert charakterisiert (ELISA, Sequenzanalyse, elektrophoretische Mobilitäts-Shiftassays, Kompetitions ELISA, Oberflächen-Plasmonresonanz-analyse, Gelfiltration). Durch Epitopmapping konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die beiden ADC-spezifischen Antikörperfragmente scFvADC3 und scFvADC7 an zwei unterschiedliche und nicht überlappende Epitope auf ADC binden, während das ODC-spezifische Antikörperfragment scFvODC1 ein von scFvODC3, 7 und 15 unterschiedliches Epitop auf ODC erkannte. In vitro Assays zeigten dass, die Aktivität der humanen ODC nach Zugabe von 3,4 mM scFvODC1 und scFvODC3 um 75% bzw. 92% verbessert wurde. Alle selektionierten scFvs wurden in den Pflanzenexpressionsvektor pTRA umkloniert und unter Verwendung diverser Targetingsignale in Tabak exprimiert, wobei die höchsten Expressionsraten nach Retardierung im ER erreicht wurden. Interessanterweise konnten die scFvODC1 und scFvODC3 in hohen Mengen (50-70 mg/g Frischgewicht) im Pflanzencytosol unter Beibehaltung ihrer Spezifität und Bindeeigenschaften exprimiert werden. Zudem wurden stabil transformierte Pflanzenlinien, die die ODC-spezifischen scFvODC1 und scFvODC3 im Apoplasten oder Cytosol exprimierten, generiert. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Co-Expression von ODC und SDE in doppelt transgenen Tabaklininen zu einer ~5fach erhöhten Putrescin- und Spermidin-Konzentration führt ohne dabei phänotypische Veränderungen in den transgenen Tabaklinien zu beobachten. Darüber hinaus ermöglichen die generierten ADC- oder ODC-spezifischen Antikörperfragmente die Immunomodulation des Polyaminsyntheseweges in der Pflanze. Wenn sich dieses Konzept in naher Zukunft erfolgreich umsetzen lassen könnte, dann würde diese neue Plattformtechnologie ein enormes Anwendungspotential in der modernen Pflanzenbiotechnologie haben.

Polyamines are ubiquitous low-molecular weight polycationic compounds found in all living organisms and involved in crucial developmental, physiological and metabolic processes. The majority of information available about the polyamine pathway was obtained by using a wide range of metabolic inhibitors (Evans and Malmberg, 1989; Tiburcio et al., 1990) and modulation of specific enzymatic activities via heterologous gene expression in transgenic plants. Previous studies have indicated that the polyamine pathway is tightly controlled in the end product accumulation. The objective of this study was to achieve changes in the pathway by combining genetic engineering and antibody technology approaches. ODC a key enzyme in the polyamine biosynthesis, was amplified from a human prostate cDNA library and subcloned into plant expression vector for transient expression in the apoplast, cytosol and endoplasmatic reticulum. ODC was accumulated to higher levels in plant cytosol and apoplast, while ODC targeted to ER was not detected in immunoblots. Stable transformed tobacco plants overexpressing heterolougs ODC in cytosol and apoplast were generated. Lines with the highest accumulation levels were selected for establishment of homozygous lines. The T2 generation of transgenic plants overexpressing human ODC in apoplast, ‘‘non-native compartment’’ of ODC revealed up to 32-fold elevated levels of ODC activity and accumulated significantly higher levels of putrescine. Additionaly, stable transformed tobacco plants co-expressing human ODC and chimeric human mouse SDE in apoplast were generated. Immunoblot analyses revealed that more than 80% of the lines tested co-expressed both enzymes. The best expressers showed significantly increased levels of putrescine (up to 5-fold) and spermidine (up to 4.5-fold). No increased levels of spermine were observed. The ADC, ODC and PAO key enzymes in polyamine pathway were chosen as a target for generation of specific scFv recombinant antibody fragments by phage display technology. Mice were immunized with the bacterial produced and affinity purified ADC, ODC-GST fusion protein and PAO-GST inclusion bodies. High antibody titers showed successful immunization. Three phage display libraries were constructed using the immunized mice repertoire. Recombinant antibodies were isolated by solid phase panning using bacterial ADC- and ODC-GST fusion proteins. Their specific reactivity to ADC and ODC was analysed by direct and capture ELISA. Sequence analyses revealed selection of two and four scFvs specific to ADC and ODC, respectively. Electromobility shift assays confirmed the functionality of the affinity purified scFvODC1 and scFvODC3. The binding properties of scFvODCs on soluble antigen were further verified by solution competition as monitored by surface plasmon resonance. The epitope specificity of selected scFvs was determined in ELISA and BIAcore assays. The pairwise epitope mapping indicated that scFvADC3 and scFvADC7 recognize independent epitopes in ADC, while scFvODC1 recognize a distinct epitope to scFvODC3, 7 and 15. Gel filtration assays indicated the presence of monomeric and dimeric forms of scFvODC3 and scFvODC7. In vitro assays indicated increase of the human ODC activity after addition of 3.4 mM of scFvODC1 and scFvODC3 of 75% and 92%, respectively. All selected scFvs were cloned into pTRA plant expression vector and analysed for their stability and accumulation levels in the plant cytosol, apoplast and ER. Immunoblot analyses of tobacco leaves demonstrated accumulation of scFvs in apoplast and ER with higher levels in ER. Moreover, scFvODC1 and scFvODC3 accumulated in high levels (up to 50-70 mg/g fresh weight) in the plant cytosol retaining the antigen binding specificity and activity in the reducing environment of the plant cytosol. Stable transformed plants expressing scFvODC1 and scFvODC3 specific to ODC in the apoplast and cytosol were generated. More than 67% of the regenerated plants expressed the apoplastic scFvODC1 and scFvODC3. The data presented in this study demonstrated changes in the polyamine pathway by constitutive expression of heterologous ODC and co-expression of ODC and SDE enzymes indicating that the polyamine pathway exhibit plasticity. Up to date this is the first study attempting to modulate the polyamine pathway by simultaneous expression of two enzymes involved in the polyamine synthesis. Moreover, generation of the scFvs specific to ADC and ODC key enzymes in the polyamine biosynthesis could be a valuable molecular tool for altering the pathway by using immunomodulation approaches and crossing experiments with the homozygous transgenic lines overexpressing ADC and/or ODC.

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