Directed evolution of arginine deiminase (ADI) for anti-tumor application

Zhu, Leilei; Schwaneberg, Ulrich

doi:999910019349

Directed evolution of arginine deiminase (ADI) for anti-tumor application = Gelenkte Evolution von Arginin-Deiminase (ADI) für die Anwendung in der Antitumortherapie

Zhu, Leilei (Author)

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Leilei Zhu

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

UmfangIX, 98 : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-09-14

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-33679
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/63710/files/3367.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Gerichtete Evolution (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; gelenkte Evolution (frei) ; Arginin Deiminase (frei) ; Antitumortherapie (frei) ; directed evolution (frei) ; arginine deiminase (frei) ; anti-tumor (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
rvk: WF 9720

Kurzfassung
Die Arginin Deiminase (ADI), ein Arginin degradierendes Enzym, ist an dem ersten Schritt der Arginindihydrolase involviert. ADI katalysiert die Hydrolyse von L-Arginin zu Citrullin und Ammoniak. ADI wurde als ein potentielles krebstherapeutisches Mittel für Arginin auxotrophe Tumore, wie Hepatocellular carcinomas (HCC), eingestuft. Die Anti-Tumor Anwendung von ADI für den therapeutischen Einsatz ist mit erheblichen Herausforderungen, wie geringe Aktivität der mikrobiellen ADI im physiologischen pH Bereich (7.35-7.45), kurze Halbwertzeit (~5 h) und eine hohe Antigenität. Die Pegylierung der ADI verbesserte die Effektivität der ADI als klinisches Arzneimittel, einhergehend mit der Verbesserung der Halbwertszeit im Serum und Antigenität. Das Ziel dieses Projektes ist die Verbesserung der ADI in Bezug auf ihre katalytischen Eigenschaften im physiologischen pH, durch den Einsatz der gelenkten Evolution. Protein Engineering durch rationales Design und gelenkte Evolution eröffnet die Möglichkeit die ADI an physiologische Bedingungen anzupassen. Die gelenkte Protein-Evolution wurde in den letzten Jahrzehnten zu einer vielfältigen und erfolgreichen Methode zur Anpassung von Enzymeigenschaften an industrielle Anforderungen und zum Verständnis von Struktur-Funktion Beziehungen in Biokatalysatoren. Damit die ADI im physiologischen pH Bereich verbessern werden kann, wurde ein Protokoll zur gelenkten Evolution entwickelt. Dieses beinhaltet ein kalorimetrisches Durchmusterungssystem im Mikrotiterplatten (MTP) Format basierend auf der Detektion von Citrulline mittels Diacetylmonoxime (DAM). Die Reaktionstemperatur für die Farbentwicklung und DAM Konzentrationen wurden optimiert, um eine ausreichende Sensitivität, einen geeigneten Linearen Bereich und Durchsatz zu gewährleisten. Mit dem etablierten Mikrotiterplattendurchmusterungssystem wurde, zum ersten Mal, eine verbesserte ADI Variante im physiologischen pH Bereiche (7.4), mit großem Potential in der medizinischen Anwendung, generiert. Nach einer ortsgerichteten Mutagenese und der ersten Runde der gelenkten Evolution (Durchmusterung einer epPCR Mutantenbibliothek) wurde die Variante M2 (K5T/D44E/H404R) generiert. M2 zeigt einen 4-fach verbesserten Kcat Wert gegenüber dem Wildtyp (PpADI), eine Verschiebung des pH Optimums (um 0.5 Einheiten) und einen 3.6-fach verbesserten Km Wert unter Durchmusterungsbedingungen (0.5 M Natriumphosphatpuffer). Ein geringer Km (S0.5) Wert für ADI ist, aufgrund der geringen Argininkonzentration im menschlichen Plasma (100-120 µM), ein wichtiger Faktor für den Effizienten Verbrauch des Arginins. Aus diesem Grund wurde nach der erfolgreichen Überprüfung des Konzepts der gelenkten Evolution für PpADI, das Ziel verfolgt den Km Wert der PpADI gegenüber Arginin zu verringern und zugleich den kcat weiter zu erhöhen, um die Effektivität der Arginin Umsetzung durch ADI zu steigern. Das in diesem Projekt etablierte kalorimetrische Citrullin Durchmusterungssystem im 96 Well Mikrotiterplattenformat wurde optimiert, um die Anwendungsbedingungen zu simulieren: PBS Puffer und 1 mM Arginin wurden in dem Durchmusterungssystem verwendet. Nach der zweiten Runde der gelenkten Evolution (Durchmusterung einer epPCR Mutantenbibliothek) und einer weiteren ortsgerichteten Mutagenese, wurden die Varianten M5 (K5T/D38H/D44E/A128T/H404R) und M6 (K5T/D38H/D44E/A128T/E296K/H404R) generiert: der S0.5 Wert verringerte sich von 2.01 mM (parent M3, K5T/D44E/A128T/H404R) auf 1.48 mM mM (M5) und 0.81 mM (M6) in pH 7.4 (PBS Puffer). Im physiologischem pH Bereich mit PBS Puffer, ist der S0.5 Wert der Variante M6 (0.81 mM) geringer als des des Wildtyps PpADI (1.30 mM); der kcat Wert wurde von 0.18 s-1 (Wildtyp PpADI) auf 17.56 s-1 (M5, 97.6-fach) und 11.64 s-1 (M6, 64.7 fach) gesteigert.

Arginine deiminase (ADI), an arginine-degrading enzyme, is involved in the first step of arginine dihydrolase pathway. It catalyzes the hydrolysis of L-arginine to form citrulline and ammonia. ADI has been studied as a potential cancer therapeutic agent for the arginine-auxotrophic tumors, such as hepatocellular carcinomas (HCC) and melanomas. Furthermore, studies also indicate that ADI is a potential anti-angiogenic agent; therefore it could become a novel anti-cancer drug targeting the neovascularization-related tumors. Studies show ADI is more potent for the treatment of leukemia than L-asparaginase. However, the anti-tumor application of ADI for therapeutic purpose faces considerable challenges, such as, microbial ADI has low activity at physiological pH (7.35~7.45), short circulating half-life (~5 h) and high antigenicity. Pegylation of ADI improved its efficacy as a clinical drug, including its half-life in serum and antigenicity. The aim of the project is to improve ADI catalytic performance at physiological pH by directed evolution. Protein engineering by rational design and directed evolution offers opportunities to tailor ADI properties to physiological conditions. Directed protein evolution has over the last decades become a versatile and successful approach for tailoring protein properties to industrial demands and for advancing our understanding of structure-function relationships in biocatalysts. Unlike rational design relying on the gathering of extensive structure-function relationships of enzymes, directed evolution is used to reengineer enzyme properties through iterative rounds of diversity generation and function selection for improved variants. In order to improve the ADI activity at physiological pH, we established a directed evolution protocol for this purpose. A microtiter plate (MTP) format colorimetric screening assay based on citrulline detection with diacetyl monoxime (DAM) was developed. Reaction temperature for color development and DAM concentration were optimized to ensure sufficient sensitivity, appropriate linear range and throughput. With the optimized assay and PpADI wild type expressed in E. coli as a model protein, true standard deviation 12.8% was obtained, which is appropriate for the library screening. With the established microtiter plate assay system, for the first time, we reengineered ADI for improved activity at physiological pH (pH 7.4) with higher potency in medical application. After one site directed mutagenesis and one round of epPCR library screening, variant M2 (K5T/D44E/H404R) was obtained. M2 shows 4-fold improved kcat value than the PpADI wild type, a shifted pH optimum at pH 7.0 (by 0.5 pH unit), and however an increased Km value, 3.6-fold under assay conditions (0.5 M sodium phosphate buffer). Low Km (S0.5) value for ADI is an important factor for efficient consume of arginine in plasma because of the low arginine concentration in human plasma (100-120 µM). Therefore after our proof of concept of reengineering PpADI by directed evolution, we aim to decrease the Km value of PpADI towards arginine and improve the kcat furthermore thereby improve the efficiency of arginine depletion by ADI. The established citrulline colorimetric assay in 96-well microtiter plate is improved to reflect application conditions: PBS buffer and 1 mM arginine were used in screening system. After the second round of epPCR library and site directed mutagenesis, variant M5 (K5T/D38H/D44E/A128T/H404R) and M6 (K5T/D38H/D44E/A128T/E296K/H404R) were generated: at pH 7.4 (PBS buffer), the S0.5 value decrease from 2.01 mM (parent M3, K5T/D44E/A128T/H404R) to 1.48 mM (M5) and 0.81 mM (M6). Under physiological pH in PBS buffer, the S0.5 value of M6 (0.81 mM) is lower than that of PpADI wild type (1.30 mM); the kcat value improved from 0.18 s-1 (PpADI wild type) to 17.56 s-1 (M5, 97.6-folds) and 11.64 s-1 (M6, 64.7-fold).

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