Structure, function, and mechanism of human MIF and parasitic orthologs

Zierow, Swen; Wolf, Klaus; Bernhagen, Jürgen

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-26550

Structure, function, and mechanism of human MIF and parasitic orthologs = Struktur, Funktion und Mechanismus von humanem MIF und parasitären MIF Orthologen

Zierow, Swen (Author)^RWTH*

2008 & 2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Swen Zierow

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangV, 112 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Prüfungsjahr: 2008. - Publikationsjahr: 2010

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Bernhagen, Jürgen (Thesis advisor)^RWTH* ; Wolf, Klaus (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-12-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-26550
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/63712/files/2655.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cytokine (Genormte SW) ; Makrophagen-Inhibitionsfaktor (Genormte SW) ; Leishmania major (Genormte SW) ; Plasmodium falciparum (Genormte SW) ; Kristallstruktur (Genormte SW) ; Immunreaktion (Genormte SW) ; Inhibitor (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Immunevasion (frei) ; Chemokin (frei) ; chemokine (frei) ; macrophage migration inhibitory factor (frei) ; small molecule inhibitor (frei) ; immune evasion (frei) ; MIF-orthologs (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Zytokin macrophage migration inhibitory factor (MIF) ist ein wichtiger Mediator der angeborenen und der adaptiven Immunantwort und spielt eine bedeutende Rolle in der Entstehung einer Vielzahl von inflammatorischen Krankheiten. MIF ist notwendig für eine effektive Immunabwehr von Infektionskrankheiten. Eine erhöhte MIF Produktion steht jedoch auch in direkter Korrelation mit einem negativen Verlauf verschiedenster Krankheiten wie adult respiratory distress syndrome (ARDS), septischem Schock, rheumatischer Arthritis, Arteriosklerose und Krebs. Zusätzlich wurde in den letzten Jahren gezeigt, dass MIF ebenfalls wichtige Funktionen in der Immunabwehr von Parasiten ausübt. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden MIF-neutralisierende Strategien als potenzieller therapeutischer Weg für mit MIF in Verbindung stehenden Krankheiten vorgeschlagen. Viele dieser anti-MIF Therapien Zielen auf die Inhibierung einer evolutionär konservierten enzymatischen Aktivität von MIF über kleine molekulare Inhibitoren. Diese Doktorarbeit beschreibt 4-Iodo-6-Phenylpyrimidin (4-IPP), einen neuartigen MIF-Inhibitor, der die katalytische Aktivität von MIF ~ 5-10-fach stärker inhibiert als andere prototypische MIF Inhibitoren. Kristallographische Studien zeigen, dass 4-IPP kovalent an das katalytisch aktive N-terminale Prolin von MIF bindet und dadurch als Suizid-Substrat fungiert. In Folge dieser kovalenten Modifikation verliert MIF seine chemoattraktive Funktion auf Monozyten. Weiterhin beschreibt diese Arbeit zwei parasitäre MIF-Orthologe, welche von den obligat intrazellulären Parasiten Leishmania major (LmMIF) und Plasmodium falciparum (PfMIF) produziert werden. Interesse an Struktur und Funktion dieser parasitären MIF-Orthologen entstand aufgrund ihrer potenziellen immunevasiven Eigenschaften und ihrer Wirkung auf Wirts-MIF als Mediator der Immunantwort. Durch die Co-Evolution mit dem Immunsystem haben parasitäre Organsimen hochspezifische Mechanismen entwickelt um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen und somit ihre Überlebenschancen zu erhöhen. Um zu untersuchen, ob LmMIF und PfMIF als immunevasive Genprodukte fungieren könnten, wurden die parasitären Proteine rekombinant produziert und aufgereinigt. Im Anschluss konnte gezeigt werden, dass LmMIF und PfMIF den humanen MIF-Rezeptor CD74 binden (Kd ~ 28 nM) und dass LmMIF wie sein mammalisches Pendant von Makrophagen internalisiert wird, die Migration von Monozyten induziert, die Signalkaskade der ERK1/2-MAP-Kinase aktiviert, die p53-abhängige Apoptose von Makrophagen inhibiert und das Golgi-assoziierte Protein p115 bindet. Weiterhin zeigten Kristallstrukturanalysen (1.03 Å), dass das Leishmania MIF Protein starke strukturelle Homologie zu dem humanen MIF Protein aufweist. Detaillierte Analysen der drei-dimensionalen Strukturen der beiden Proteine offenbarten jedoch auch klare strukturelle Unterschiede zwischen den jeweiligen enzymatisch aktiven Zentren der N-terminalen Regionen. Diese Unterschiede spiegeln sich wider in enzymatischen Assays, welche zeigten, dass selektive, Spezies-spezifische Inhibierung durch kleine molekulare Inhibitoren dieser katalytischen Regionen möglich ist. Abschließend wurde die molekulare Grundlage der Interaktion zwischen MIF und dem Chemokin-Rezeptor CXCR4 studiert. Diese Arbeit beschreibt die Bindung der N-terminalen extrazellulären Region des CXCR4 Rezeptors (Aminosäuren 1-27) mit humanem MIF und Leishmania major MIF durch einen kompetitiven Bindungsassay und durch NMR-Studien. Steady-state Fluoreszenz-spektroskopische Studien führten zu der Ermittlung einer Dissoziationskonstante von 3.1 µM. Diese gezeigte Interaktion des N-terminalen CXCR4-Peptids mit MIF führt zur effektiven Inhibierung der LmMIF/MIF-induzierten Migration von Monozyten. In dieser Arbeit wurden durch die kristallographische Charakterisierung des prototypischen MIF-Inhibitors 4-IPP eine neue Grundlage für eine potenzielle Behandlung von MIF-assoziierten Autoimmun- und inflammatorischen Krankheiten geschaffen. Zusätzlich wurden durch die Studien von parasitären MIF-Orthologen neue Wege aufgezeigt wie Parasiten das Immunsystem des Wirtes korrumpieren könnten. Weitere Analysen der molekularen Interaktionsmechanismen von MIF und dessen Bindungspartnern können neue Möglichkeiten zur spezifischen Inhibierung dieser Interaktionen bieten und so zur Entwicklung neuer pharmakologischer Inhibitoren beitragen, die nicht nur vorteilhaft in MIF-assoziierten Krankheiten sind, sondern auch die immunevasiven Strategien von Parasiten neutralisieren.

The cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a key mediator of the innate and adaptive immune system and plays a critical role in many inflammatory diseases. MIF is required to combat serious infections; however, high-level production of MIF has been linked to a severe outcome of many diseases including adult respiratory distress syndrome, septic shock, rheumatoid arthritis, atherosclerosis and cancer. Over the last years, MIF has also been ascribed important functions in the host defense against several parasitic infections. Consequently, anti-MIF therapies have been suggested as a potential therapeutic approach for treating MIF-related diseases. Unique among cytokines, MIF possesses an enzymatic activity that is evolutionarily conserved. Herein, 4-iodo-6-phenylpyrimidine (4-IPP), a MIF inhibitor which is ~ 5-10 times more potent in blocking MIF-dependent catalysis than other prototypical MIF inhibitors is described. Crystallographic studies reveal 4-IPP to serve as a suicide substrate for MIF, resulting in the covalent modification of the catalytically active N-terminal proline and loss of function of MIF-induced monocyte migration. Additionally, two parasitic orthologs of MIF, which are produced by the obligate intracellular parasites, Leishmania major (LmMIF) and Plasmodium falciparum (PfMIF) were studied. An interest in the structure and function of MIF orthologs from parasites has emerged recently as they might have relevant functions in corrupting the host MIF’s induced immune defense mechanisms. By co-evolving with the immune system, parasitic organisms have evolved specialized strategies to circumvent the host’s immune defense mechanisms to increase their own chances of survival. To assess whether LmMIF and PfMIF have the potential to disrupt immunological pathways of the host’s immune system, the parasitic proteins were recombinantly produced and purified. LmMIF and PfMIF show significant binding interaction with the human MIF receptor, CD74 (Kd ~ 28 nM), and like its mammalian counterpart, the recombinant LmMIF protein is internalized by macrophages, induces monocyte cell migration, ERK1/2 MAP kinase activation, inhibits the activation-induced apoptosis of macrophages and binds the Golgi-associated tethering protein p115. The Leishmania MIF protein shows significant structural homology with human MIF as revealed by a high-resolution x-ray crystal structure (1.03 Å). Significant differences between the two proteins in the N-terminal tautomerization site are evident, and evidence for the selective, species-specific inhibition of MIF by small-molecule antagonists that target this site is provided. Finally, this thesis was aimed to further elucidate the molecular basis of MIF’s chemokine-like functions which were recently shown to be mediated through interaction to the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2. However, the molecular details of this interaction have not yet been determined. Herein, a peptide derived from the N-terminal extracellular region of the CXCR4 receptor as a site of interaction with human MIF and Leishmania major MIF is described. From a competitive binding assay and 1H15N chemical shift perturbation studies, a direct binding interaction between MIF and the N-terminal 27 residues of CXCR4 is shown. Titration studies using steady-state fluorescence spectroscopy resulted in a dissociation constant of 3.1 µM. Notably, LmMIF/MIF-triggered monocyte chemotaxis activity is ablated by this N-terminal CXCR4 peptide. The present study not only provides a crystallographic characterization of the prototypic MIF inhibitor 4-IPP for a potential treatment of MIF-related autoimmune and inflammatory diseases, but also unfolds possible new pathways of parasitic MIF-orthologs to interfere with the host immune system. The study of the molecular mode of interaction of MIF and its binding partners will provide new opportunities to block these interactions specifically, and thus may aid in the design of new drugs targeting MIF-related diseases and immune evasive strategies of parasites.

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