In vitro and in vivo analysis of the CXC chemokine receptor 6 in leukocyte recruitment and allergic lung inflammation

Koenen, Andrea; Wagner, Hermann; Ludwig, Andreas

doi:HT019025160

In vitro and in vivo analysis of the CXC chemokine receptor 6 in leukocyte recruitment and allergic lung inflammation = In vitro und in vivo Analyse des CXC Chemokinrezeptors 6 in der Leukozytenrekrutierung und der allergischen Lungenentzündung

Koenen, Andrea

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin Andrea Koenen

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (iv, 168 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Ludwig, Andreas (Thesis advisor) ; Wagner, Hermann (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-05-13

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-042414
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/658461/files/658461.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/658461/files/658461.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
CXCR6 (frei) ; Chemokin-Rezeptor (frei) ; chemokine receptor (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Der Chemokinrezeptor CXCR6 vermittelt die Rekrutierung von T-Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen in Entzündungsreaktionen und Krebserkrankungen. Das CXC-Chemokin CXCL16 ist der einzig bekannte Ligand des CXCR6 und kann als Adhäsion-vermittelnde transmembrane Variante sowie als chemotaktisch aktive soluble Variante an den Rezeptor binden. Wie alle anderen Chemokinrezeptoren ist CXCR6 ein heptahelikaler G Protein gekoppelter Rezeptor. Die Kopplung des G Proteins wird durch das sogenannte D3.49R3.50Y3.51 Motiv vermittelt. CXCR6 trägt jedoch ein für Chemokinrezeptoren einzigartiges DRF-Motiv. Bisher wurde die physiologische Bedeutung dieser natürlichen Y3.51F Mutation im CXCR6 und die Funktion des Rezeptors während der Ausbildung asthmatischer Lungenentzündung nicht näher untersucht. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Relevanz des DRF-Motivs des CXCR6 mit speziellem Fokus auf Signalkaskaden, welche zur Zellmigration führen. Humane embryonale Nieren–Zellen (HEK293) und monozytäre THP 1 Zellen wurden transduziert, um unterschiedliche CXCR6-Varianten zu exprimieren: eine DRF-Variante, welche das endogene Motiv exprimierte, eine Variante, welche ein DNF-Motiv trug, von dem angenommen wird, dass es die Kopplung des G Proteins unterbindet, und eine Variante, welche das in anderen Chemokinrezeptoren exprimierte DRY-Motiv enthielt. In HEK293 Zellen führte die CXCR6-CXCL16 Interaktion zur Adhäsion und zur Dynamin-abhängigen Internalisierung, gefolgt vom Recycling des Rezeptors zurück an die Zelloberfläche. Keiner dieser Mechanismen wurde durch Modifikationen des DRF-Motivs beeinflusst. Hingegen wurde der CXCL16-induzierte Calciumeinstrom durch die Mutation des DRF- zu einem DNF-Motiv unterbunden. In THP-1 Zellen vermittelte das natürliche DRF-Motiv Zelladhäsion, Akt Phosphorylierung, Calciumeinstrom und Zellmigration. Alle diese Prozesse wurden durch die DNF Mutation inhibiert. Auffällig war die Verstärkung des intrazellulären Calciumeinstroms und die verstärkte CXCL16-induzierte Migration bei Expression der DRY-Variante, wobei die Liganden-Bindung und Akt Phosphorylierung, verglichen mit der DRF Variante, unverändert blieben. Vice versa Veränderungen des endogenen DRY-Motivs des Chemokinrezeptors CX3CR1 verringerten die CX3CL1-stimulierte Zellmigration. Anders als beim CXCR6, wurde die CX3CR1-vermittelte Adhäsion an CX3CL1 nicht durch eine Inhibition der G Protein Kopplung herabgesetzt. Daher könnte die Expression des DRF-Motivs im CXCR6 möglicherweise eine spezielle Adaptation darstellen, die den Rückhalt von Immunzellen im Gewebe durch Adhäsion an membranständiges CXCL16 ermöglicht, ohne dabei verstärkte Zellmigration durch lösliches CXCL16 auszulösen. Durch in vivo Studien wurde die Rolle des CXCR6 in subchronischem (35-Tage Modell) und chronischem (110-Tage Modell) murinen Asthma untersucht. Nach Ausbildung von subchronischem OVA-induziertem Asthma zeigten CXCR6+/GFP und CXCR6GFP/GFP Mäuse keine Unterschiede bezüglich IgE-Serumgehalt, Leukozytenrekrutierung in den Alveolarraum oder Zytokin-Expression. Nach der Induktion chronischen Asthmas zeigten sich jedoch verstärkte Remodellierungsprozesse im Lungengewebe von CXCR6GFP/GFP Mäusen im Vergleich zu CXCR6+/GFP Mäusen. Vor allem die Septendicke und die basale Konstriktion kleiner Atemwege und Bronchiolen waren in CXCR6GFP/GFP Mäusen erhöht. Weiterhin zeigten CXCR6GFP/GFP Mäuse eine verringerte Anzahl an CD4-positiven Lymphozyten im Alveolarraum. Insgesamt zeigte sich, dass CXCR6 die Rekrutierung von Immunzellen in die Lunge während der akuten Phase des Asthmas nicht beeinflusst, wohingegen die Retention von CD4-positiven Zellen CXCR6-vermittelt zu sein scheint. Letzteres vermag Remodellierungsprozesse in der Lunge während der Chronifikation murinen Asthmas zu beeinflussen.Da CXCL16 auf Endothelzellen durch ADAM10 proteolytisch prozessiert wird, wurde untersucht, inwiefern endotheliales ADAM10 die Ausbildung subchronischen murinen Asthmas beeinflusst. Nach 35 Tagen der OVA-Behandlung zeigten Lungen von Tie2 Adam10-/- Mäusen reduzierte Charakteristika der Entzündung. Auffällig waren vor allem die reduzierte Zellrekrutierung, Zytokinfreisetzung und Mukusproduktion in Lungen der Tie2 Adam10-/- Mäuse. Damit zeigte die vorliegende Arbeit eine pro-asthmatische Funktion endothelialer ADAM10. Diese pro-asthmatische Funktion war schon in der akuten Phase des Asthmas offensichtlich, während CXCR6 zu diesem Zeitpunkt keine detektierbare Relevanz hatte und eine erhöhte Freisetzung von solublen CXCL16 nicht beobachtet werden konnte. Dies lässt vermuten, dass andere ADAM10-Substrate auf endothelialen Zellen, wie VE-Cadherin, die endotheliale Permeabilität und die Rekrutierung von Immunzellen in den Alveolarraum fördern. Es konnte gezeigt werden, dass CXCR6 im Hinblick auf die Funktion des DRF-Motivs in der Zellrekrutierung und -Adhäsion einzigartig in der Familie der Chemokinrezeptoren ist. Die besondere Funktion der Adhäsion könnte essentiell für die Retention von CD4-positiven Zellen an CXCL16 exprimierenden Zellen sein und dadurch inflammatorische Prozesse während der späten Phase des Asthmas beeinflussen. Im Gegensatz dazu übt endotheliales ADAM10 seine pro-asthmatische Wirkung schon in der frühen Phase des Asthmas aus, wofür die Prozessierung von anderen Substraten als CXCL16 von Bedeutung zu sein scheint.

The chemokine receptor CXCR6 mediates recruitment of T-lymphocytes, plasma cells and macrophages to sites of inflammation and cancer. The only known ligand of CXCR6 is the CXC-chemokine CXCL16, which exists as a transmembrane variant mediating cell-cell adhesion and as a soluble variant acting as a chemoattractant. Like all chemokine receptors, CXCR6 is a heptahelical G protein-coupled receptor. G protein coupling is usually mediated by a D3.49R3.50Y3.51 motif at the interface of the third transmembrane region and the second intracellular loop of chemokine receptors. However, CXCR6 carries a unique D3.49R3.50F3.51 motif at this position. Yet, the relevance of the DRF motif in CXCR6 and the function of the receptor in the development of asthmatic lung inflammation remain unclear. The present thesis investigated the importance of the DRF motif of CXCR6 particularly with regard to signalling processes resulting in cell migration. Human embryonic kidney HEK293 cells and monocytic THP-1 cells were transduced to express three different receptor variants carrying different motifs: the natural DRF motif, a DNF mutation, which is thought to disrupt G protein binding, and a mutant with the canonical DRY motif of the other chemokine receptors. In HEK293 cells CXCR6-CXCL16 interaction mediated adhesion and dynamin-dependent internalisation, followed by rapid recycling of the receptor back to the cell surface. Neither of these mechanisms required the DRF motif. In contrast, CXCL16-induced calcium influx was abrogated when DRF was mutated in DNF. In THP 1 cells CXCR6 carrying the DRF motif mediated cell adhesion to immobilized CXCL16, Akt signalling, calcium influx and cell migration in response to CXCL16. All three responses were abrogated by the DNF mutation. Notably, the DRY mutation increased calcium influx and migration induced by CXCL16, but did not affect ligand binding or Akt signalling compared to the DRF variant. Vice versa replacement of the endogenous DRY motif in CX3CR1 by DRF led to decreased cell migration in response to CX3CL1 without influencing binding to CX3CL1. However, in contrast to CXCR6, adhesion via CX3CL1 was not affected by the inhibition of G protein coupling. Thus, the presence of the DRF motif in CXCR6 might represent an adaptation of the receptor for predominantly mediating retention of immune cells to tissues via adhesion to immobilized CXCL16 rather than induction of cell migration in response to soluble CXCL16. In vivo studies addressed the role of CXCR6 in subchronic (35-days model) and chronic (110-days models) experimental murine asthma. After provoking Ovalbumin (OVA)-induced asthma in a subchronic way, CXCR6+/GFP and CXCR6GFP/GFP mice showed equal responses to OVA. In both mice genotypes increased IgE serum levels, cell recruitment into the alveolar space and similar cytokine release and expression were detectable. In contrast, after induction of chronic asthma, remodelling of lung tissue was more severe in CXCR6GFP/GFP mice than in CXCR6+/GFP mice. Especially septa thickness and the construction of bronchioles and small airways were more increased in lungs of CXCRGFP/GFP mice. Furthermore, CXCR6GFP/GFP mice showed decreased levels of CD4-positive lymphocyte in BAL-fluid. Taken together, CXCR6 does not influence the recruitment of lymphocytes into the lung during the acute phase of asthma, but seems to mediate retention of CD4-positive lymphocytes in the chronic phase. This might influence the remodelling process in lung tissue during the chronification of murine asthma.Since CXCL16 is cleaved by ADAM10 on endothelial cells, this study additionally addressed the question whether and how endothelial ADAM10 affects the development of subchronic murine asthma. After 35 days of OVA treatment, lungs of Tie2 Adam10-/- mice showed reduced markers of lung inflammation. Reduction in cell recruitment, cytokine release and mucus production in Tie2 Adam10-/- mice compared to littermates were detectable. Therefore, the present thesis uncovered a pro-asthmatic role of endothelial ADAM10. This pro-asthmatic effect was evident already during the acute phase of asthma, in which CXCR6 plays no role, and altered CXCL16 shedding was not observed. This suggests that cleavage of other ADAM10 substrates on endothelial cells, like VE cadherin could promote endothelial permeability and also increase cell recruitment into the alveolar space.Thus, CXCR6 is unique within the chemokine receptor family with respect to the function of its DRF motif in cell recruitment and adhesion. The adhesive function of the receptor could be required for the retention of CD4-positive cells to cells expressing transmembrane CXCL16 and promote inflammation in the late phase of asthma. In contrast, to CXCR6, endothelial ADAM10 acts pro-asthmatic already in the acute phase most probably by mediating shedding of other substrates than transmembrane CXCL16.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)