Spezifische DNA-Antikörper Konjugate zur selektiven Adressierung von humanen Zellen

Hanz, Gisela Maria; Albrecht, Markus; Weinhold, Elmar

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-083245

Spezifische DNA-Antikörper Konjugate zur selektiven Adressierung von humanen Zellen = Specific DNA-antibody conjugates for selective targeting of human cells

Hanz, Gisela Maria

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Gisela Maria Hanz (M.Sc. RWTH)

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (IX, 184 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor) ; Albrecht, Markus (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-083245
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/672823/files/672823.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/672823/files/672823.pdf?subformat=pdfa

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Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chemie (frei) ; bioorganische Chemie (frei) ; DNA-Protein Konjugate (frei) ; DNA-Antikörper Konjugate (frei) ; spezifische Adressierung von Zellen (frei) ; sequenzspezifische Modifikation von DNA (frei) ; DNA-Methyltransferasen (frei) ; AdoMet-Analoga (frei) ; SNAP-tag Technologie (frei) ; para-substituierte Benzylguanin-Derivate (frei) ; spezifische Markierung von DNA (frei) ; Antikörper (frei) ; Antikörperfragmente (frei) ; Krebszellen (frei) ; humane Zellen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Der gezielte Transfer von Genen in bestimmte Zellen stellt immer noch eine große Herausforderung für gentherapeutische Ansätze dar. Einer dieser Ansätze macht sich die Tatsache zu Nutze, dass Krebszellen und gesunde Zellen ein unterschiedliches Rezeptorexpressionsmuster aufweisen. Die Unterschiede in der Oberflächenrezeptorexpression werden dazu genutzt Krebszellen selektiv zu adressieren. Ziel dieser Arbeit war es DNA, die für ein Gen codiert, in den Zellkern einer humanen Krebszelle einzuschleusen. Die DNA wurde dazu mit einem Antikörperfragment konjugiert, das von Rezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt und gebunden werden kann. Dabei wurde die DNA sequenzspezifisch in einer Region modifiziert die nicht für das Gen codiert, um Probleme bei der Transkription zu vermeiden. Die sequenzspezifische Markierung der DNA mit Antikörperfragmenten wurde durch die Kombination der SNAP-tag Technologie mit der sequenzspezifischen Modifikation von DNA, mit Hilfe einer DNA-Methyltransferase (MTase) erreicht. Das SNAP-tag Protein ist eine Variante der humanen O6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase, die mit dem gewünschten Antikörperfragment genetisch fusioniert wird und selektiv mit para-substituierten Benzylguanin -Derivaten (BG) reagiert. DNA-MTasen akzeptieren nicht nur den natürlichen Cofaktor S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet), sondern übertragen auch artifizielle Cofaktoren auf DNA, innerhalb ihrer Erkennungssequenz. Hier wurden zwei verschieden Arten von Cofaktoranaloga eingesetzt, N-Adenosylaziridin Cofaktoren und doppelt-aktivierte Cofaktoren, die ein BG tragen. Im ersten Schritt wurde die Substrat-DNA sequenzspezifisch mit BG modifiziert und anschließend mit einem SNAP-tag Fusionsprotein markiert.Die Methode wurde anhand der Modellverbindungen pBR322 und HisSNAP-YFP entwickelt. Für die sequenzspezifische Modifikation der DNA wurden vier Cofaktoranaloga mit verschiedenen Linkerlängen synthetisiert: 6BGAz, 6BG8Az, AdoInBG3 und AdoInBG35. Versuche mit AdoInBG35 (längster Linker) zeigten die beste Kupplungseffizienz mit der DNA-MTase M.BseCI und den SNAP-tag Proteinen.Für die Versuche mit humanen Zellen wurde Plasmid-DNA verwendet, die das Gen für das green fluorescent protein (GFP) trägt und über eine (pGFP, 1 x) bzw. zehn Erkennungssequenzen (pGFP+I, 10 x) für die DNA-MTase M.BseCI verfügt. Beide Plasmide, pGFP (1 x) und pGFP+I (10 x), wurden mit M.BseCI und AdoInBG35 modifiziert. Zur Markierung der DNA wurde das Antikörper-SNAP Protein scFv-425-SNAP genutzt, welches selektiv von Zellen mit dem epidermal growth factor receptor (EGFR) erkannt wird. Für die Zellversuche wurden deshalb die EGFR+-Zelllinien A431 (Epidermalkrebs) und MDA-MB-468 (Brustkrebs) benutzt. Zur Visualisierung der Konjugatbindung an die Zelloberfläche wurden die Plasmide zusätzlich sequenzspezifisch mit dem Fluorophor 5(6)-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) markiert. Die fluoreszierenden Konjugate scFv-425-pGFP-TAMRA (1 x) und scFv-425-pGFP+I-TAMRA (10 x) wurden mit den Zellen inkubiert und konnten durch FACS und Konfokalmikroskopie beobachtet werden. Sowohl die Bindung, als auch die Aufnahme der Konjugate in EGFR+-Zellen konnten beobachtet werden. Anschließende Transfektionsexperimente mit den Konjugaten scFv-425-pGFP (1 x) und scFv-425-pGFP+I (10 x), ohne Fluorophor, zeigten zunächst keine Expression von GFP. Sie wurde jedoch mit scFv-425-pGFP+I (10 x) unter Selektionsdruck mit dem Antibiotikum G814 beobachtet. Das hier entwickelte Verfahren zur Konjugation von DNA mit Proteinen ist eine effektive und einfache Methode (lange) DNA sequenzspezifisch und mit definierter Stöchiometrie zu modifizieren. Die Markierung der DNA innerhalb wichtiger DNA-Sequenzen kann dabei vermieden werden. Durch den Einsatz von körpereigenen Stoffen (DNA und Protein) ist eine ausreichende Biokompatibilität des Konjugats gewährleistet. Durch das gezielte Ansprechen von Zellen kann außerdem eine unspezifische Aktivität des Konjugats vermieden werden.

Targeted delivery of genes into specific cells is still a challenging task for gene therapeutic approaches. One is based upon the fact, that cancer cells and healthy cells show different receptor expression patterns. The difference in surface receptor expression can be used to selectively address cells. In this thesis DNA, encoding for a gene, was introduced into the nucleus of human cancer cells. The DNA was conjugated with an antibody fragment that is recognized and bound by receptors on the cell surface. It is important to modify the DNA sequence-specifically in a region that is not encoding for the gene, to avoid complications during transcription of the gene. This was achieved by combination of the SNAP-tag technology with sequence-specific modification of DNA with a DNA-methyltransferase (MTase). The SNAP-tag is a mutant of the human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, which can be genetically fused to the desired antibody fragment and reacts specifically with para-substituted benzylguanine derivatives (BG). DNA-MTases catalyze the sequence-specific transfer of a methyl group from the natural cofactor S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to DNA, within their recognition sequence. However DNA-MTases can be used as tools for specific labeling of DNA with synthetic cofactors. Here two types of cofactor analogues, N-adenosylaziridine cofactors and double-activated cofactors, which carry a BG, have been developed. They were used to couple BG sequence-specifically to DNA, which is then reacted with a SNAP-tag fusion protein to yield the desired DNA-protein conjugate.The method was developed with the model compounds pBR322 and HisSNAP-YFP. For the sequence-specific modification of DNA four cofactor analogues with different linker lengths were developed: 6BGAz, 6BG8Az, AdoYnBG3 and AdoYnBG35. Experiments with AdoYnBG35 (longest linker) showed the best coupling efficiency with DNA-MTase M.BseCI and the SNAP-tag proteins. For experiments with human cancer cells plasmid DNA with the gene for green fluorescent protein (GFP) and one (pGFP, 1 x) or ten recognition sites (pGFP+I, 10 x) for M.BseCI were used. Both plasmids, pGFP (1 x) and pGFP+I (10 x), were modified sequence-specifically with M.BseCI and AdoYnBG35. The antibody-SNAP protein scFv-425-SNAP was used for labeling of the BG-modified DNA. It is recognized specifically by cells which overexpress the epidermal growth factor receptor (EGFR). Cellular experiments were therefore carried out with EGFR+ cell lines A431 (epidermal cancer) and MDA-MB-468 (breast cancer). For cellular binding experiments the DNA was additionally modified with the fluorophore 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) sequence-specifically, to visualize binding of the conjugate to the cell surface. The fluorescent conjugates scFv-425-pGFP-TAMRA (1 x) and scFv-425-pGFP+I-TAMRA (10 x) were incubated with the cells and were observed through FACS and confocal microscopy. Binding as well as internalization of the conjugates were noticed with EGFR+ cells. Subsequent transfection experiments with the conjugates scFv-425-pGFP (1 x) and scFv-425-pGFP+I (10 x), without fluorophore, did not show GFP expression initially. However, the application of selection pressure through G814 antibiotic yielded GFP expression.This method for the specific conjugation of DNA with proteins is an effective and easy way to perform sequence-specific modification of (long) DNA with a defined stoichiometry. In addition labeling of DNA within an essential DNA sequence can be avoided. Endogenous substances (DNA and protein) assure sufficient biocompatibility of the conjugates, while targeted addressing of cells suppresses unspecific reactions.

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