Regulierbare somatische ex vivo Gentherapie zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen mittels PEDF

Harmening, Nina; Panstruga, Ralph; Thumann, Gabriele

doi:10.18154/RWTH-2017-00417

Regulierbare somatische ex vivo Gentherapie zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen mittels PEDF = Regulatable somatic ex vivo gene therapy for the treatment of neurodegenerative diseases using PEDF

Harmening, Nina

2016 & 2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin Nina Harmening

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (iii, 181 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2017

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Thumann, Gabriele (Thesis advisor) ; Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-03-31

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-00417
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/681766/files/681766.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/681766/files/681766.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
gentherapie (frei) ; PEDF (frei) ; neurodegenerative Erkrankungen (frei) ; nicht-viral (frei) ; Sleeping Beauty (frei) ; Tet-On System (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung der über 60-Jährigen in Deutschland. Man unterscheidet zwischen der trockenen und der feuchten, neovaskulären Form. Die neovaskuläre Form zeichnet sich durch die Bildung choroidaler Neovaskularisationen aus, die auf eine erhöhte Konzentration des pro-angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) zurückzuführen ist. Diese Form der AMD wird zurzeit mittels anti-VEGF Antikörpern behandelt, wodurch die Neovaskularisierung und somit ein Fortschreiten der Krankheit aufgehalten werden soll. Da die verschiedenen Wirkstoffe allerdings eine geringe Halbwertzeit besitzen, sind regelmäßige intravitreale Injektionen notwendig, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Diese Therapieform ist zum einen mit hohen Kosten verbunden, zum anderen ist der regelmäßige Arztbesuch vor allem für ältere Menschen mit eingeschränktem Sehvermögen alleine nicht zu bewerkstelligen. Zudem besteht das Risiko von Nebenwirkungen, wie bspw. Infektionen des Auges, bei jeder Injektion. Die Etablierung einer additiven Gentherapie stellt eine vielversprechende Alternative zur bisherigen Behandlungsmethode dar. In diesem Therapieansatz sollen autologe retinale (RPE) oder Iris (IPE) Pigmentepithelzellen mit dem anti-angiogenen und neuroprotektiven Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF), dem natürlichen Gegenspieler des VEGF, transfiziert und subretinal transplantiert werden, wo sie rekombinantes PEDF vermehrt freisetzen und so dem Effekt von VEGF entgegenwirken, um die Neovaskularisation zu unterdrücken. Zur Transfektion der Pigmentepithelzellen wurden linearisierte Plasmide sowie das nicht-virale Sleeping Beauty (SB) Transposon System verwendet, das eine stabile und langanhaltende Expression des eingebrachten PEDF Gens gewährleistet und dabei die möglichen Komplikationen des viralen Gentransfers, wie Immunreaktionen und Mutagenese, umgeht. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse des SB-vermittelten PEDF Gentransfers, der um die Funktion eines Doxycyclin-abhängigen Regulationsmechanismus erweitert wurde. Ziel war die Regulation der Expression und somit der Menge an freigesetztem PEDF, wodurch eine personalisierte Therapie gewährleistet werden könnte. Des Weiteren wurde der Einsatz der SB100X Transposase als mRNA im Hinblick auf eine verbesserte Sicherheit des Systems untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Expression und somit die PEDF-Sezernierung mittels Tet-On System reguliert werden kann. Durch Zugabe oder Weglassen von Doxycyclin im Zellkultur-Medium konnte die Expression des jeweiligen Transgens an- und wieder abgeschaltet werden. Dies ist ein wichtiger Therapieaspekt, sollte es zu unvorhergesehenen Nebenwirkungen aufgrund einer erhöhten PEDF-Sezernierungsrate kommen. In diesem Fall wäre denkbar, dassdurch die Gabe von Doxycyclin, bspw. in Form von Augentropfen, die Expression von PEDF reguliert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine Dosis-abhängige Regulierung der Genexpression möglich ist: je höher die Doxycyclin-Konzentration, desto höher war die Expression des jeweiligen Transgens. Dies erlaubt eine individuelle Anpassung der sezernierten PEDF-Konzentration, wodurch die Erfolgschancen einer möglichen Therapie erhöht werden könnten. Experimente mit SB100X Transposase als mRNA zeigten, dass die Zellen stabil und langanhaltend transfiziert werden konnten. Diese Ergebnisse bringen das Feld der Gentherapie einen entscheidenden Schritt voran in Richtung individueller Gentherapie, bei der die Dosis des freigesetzten therapeutischen Wirkstoffes, in diesem Fall PEDF, individuell gesteuert und die Expression des Gens wenn notwendig wieder abgeschaltet werden kann. Der Gentransfer mittels nicht-viralem Sleeping Beauty Transposon System ist eine vielversprechende Methode, die zu einer langanhaltenden und stabilen Genexpression führt. Die Verwendung der Transposase als mRNA erhöht dabei die Sicherheit des Systems.

Age-related macular degeneration (AMD) is one of the main causes for the blindness of the over 60-year-olds in Germany. One differentiates between the dry and the wet, neovascular form. The neovascular form is characterized by the formation of choroidal neovascularization due to an increased concentration of the pro-angiogenic Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). This form of AMD is currently being treated by means of anti-VEGF antibodies, which should stop neovascularization and thus the progress of the disease. However, since the various drugs have a short half-life, regular intravitreal injections are necessary to achieve a therapeutic effect. This form of therapy is on the one hand associated with high costs, on the other hand, the regular doctor's visit is not possible for the elderly with limited vision alone. There is also the risk of side effects, such as eye infections, for each injection. The establishment of an additive gene therapy is a promising alternative to current treatments. In this approach, autologous retinal (RPE) or iris (IPE) pigment epithelial cells will be transfected with the anti-angiogenic and neuroprotective Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF), the natural counterpart of the VEGF, and transplanted subretinally, where they secrete recombinant PEDF, thus counteracting the effect of VEGF to suppress neovascularization. For the transfection of the pigment epithelial cells, linearized plasmids and the non-viral Sleeping Beauty (SB) transposon system were used to ensure stable and long-term expression of the introduced PEDF gene, thereby avoiding the possible complications of viral gene transfer, such as immune responses and mutagenesis. This work focused on the analysis of the SB-mediated PEDF gene transfer, which was extended by the function of a doxycycline-dependent regulatory mechanism. The aim was to regulate the expression and thus the amount of secreted PEDF, which would allow a personalized therapy to be ensured. Furthermore, the use of the SB100X transposase as mRNA was investigated to improve system safety. The results of this work showed that the expression and thus the PEDF secretion can be regulated by means of the Tet-On system. By adding or omitting doxycycline in the cell culture medium, the expression of the respective transgene could be switched on and off again. This is an important therapeutic aspect if unforeseen side effects occur due to an increased PEDF secretion rate. In this case it would be conceivable that the expression of PEDF is regulated by administration of doxycycline, for example in the form of eye drops. Furthermore, it was shown that dose-dependent regulation of gene expression is possible: the higher the doxycycline concentration, the higher the expression of the respective transgene. This allows an individual adjustment of the secreted PEDF concentration, which could increase the success potential of a possible therapy. Experiments using SB100X transposase as mRNA showed stable and long-term transfection of the cells. These results bring the field of gene therapy a decisive step forward in the direction of individual gene therapy in which the dose of the secreted therapeutic agent, in this case PEDF, can be individually controlled and the expression of the gene can be switched off again if necessary. Gene transfer using the non-viral Sleeping Beauty Transposon System is a promising method that leads to long-term and stable gene expression. The use of the transposase as mRNA increases the safety of the system.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)