Die funktionelle Charakterisierung des putativen Tumorsuppressors DKK3 im humanen Mammakarzinom sowie die Identifizierung potentieller SFRP1-Mimetika für die Brustkrebstherapie

Lorsy, Eva; Usadel, Björn; Dahl, Edgar

doi:10.18154/RWTH-2017-04585

Die funktionelle Charakterisierung des putativen Tumorsuppressors DKK3 im humanen Mammakarzinom sowie die Identifizierung potentieller SFRP1-Mimetika für die Brustkrebstherapie = The functional characterization of the putative tumor suppressor DKK3 in human mammary carcinoma and the identification of potential SFRP1-mimetics for breast cancer therapy

Lorsy, Eva

2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Eva Lorsy M. Sc. Biologie

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (XIII, 177 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Dahl, Edgar (Thesis advisor) ; Usadel, Björn (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-05-12

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-04585
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/689782/files/689782.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/689782/files/689782.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Brustkrebs (frei) ; SFRP1 (frei) ; WNT-Signalweg (frei) ; Wirkstoffentwicklung (frei) ; DKK3 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Sowohl das oftmalige Auftreten von Resistenzen gegenüber den in Anwendung befindlichen Therapien für humane Brustkrebserkrankungen als auch ein Mangel an effektiven, zielgerichteten Behandlungsmöglichkeiten, insbesondere für triple-negative Tumoren, unterstreichen den Bedarf an neuen Therapien für das humane Mammakarzinom. Einen vielversprechenden, therapeutischen Ansatzpunkt stellt der WNT-Signalweg dar, dessen Deregulation in vielen humanen Tumorentitäten, einschließlich des Mammakarzinoms, beobachtet wird und zudem mit einer schlechten Überlebensprognose assoziiert ist. Ursächlich für diese Deregulation ist in Brusttumoren oftmals ein Expressionsverlust seiner Antagonisten, zu denen unter anderem DKK3 und SFRP1 zählen.Für die Entwicklung neuer Therapieansätze ist es fundamental, zunächst die den jeweiligen Mammakarzinom-Subtypen zu Grunde liegenden molekularen Entstehungs- und Progressionsmechanismen zu entschlüsseln. Um zu diesem Ziel beizutragen, galt es im Rahmen der vorliegenden Dissertation erstmals eine umfassende Charakterisierung des putativen Tumorsuppressors DKK3 in den einzelnen Subgruppen des humanen Mamma-karzinom durchzuführen. Die unter Verwendung von drei unabhängigen Patientenkohorten (n=30, n=463 und n=791) durchgeführte Subtyp-spezifische DKK3-Expressionsanalyse offenbarte sowohl auf mRNA- als auch Proteinebene einen im Vergleich zur Normalgewebe-Expression signifikanten DKK3-Verlust in allen klinisch-relevanten Brustkrebs-Subtypen, mit der jeweils niedrigsten Expression in basalen Mammakarzinomen. Um die diesem differenziellen Expressionsverlust zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren, erfolgte eine Methylierungsanalyse des gesamten transkriptionsregulierenden Genbereichs der beiden, den DKK3-Promotor-überspannenden CpG-Inseln unter Verwendung zweier unabhängiger Patientenkohorten (n=33 und n=497). Während die Methylierung der nicht-basalen Fälle signifikant mit einem DKK3-Expressionsverlust korrelierte, wiesen basale Karzinome wider Erwarten die geringste Methylierungsfrequenz auf. Dies deutete auf einen anderweitigen Mechanismus der DKK3-Inaktivierung in diesen Tumoren hin. Die signifikante Korrelation einer niedrigen DKK3-mRNA-Expression mit einem verkürzten rezidivfreien Überleben in luminalen und basalen Mammakarzinomen wies indessen auf eine mögliche kausale Involvierung eines DKK3-Verlustes in die Tumorgenese dieser beiden Subtypen hin. Diese Hypothese sollte im Rahmen von funktionellen in vitro-Tests unter Verwendung von jeweils zwei stabilen gain-of-function-Brusttumor-Modellen der beiden Subgruppen „luminal“ und „basal“ analysiert werden. Interessanterweise wurden die deutlichsten Effekte auf das Zellwachstum und die Apoptoserate infolge forcierter DKK3-Reexpression in den beiden basalen Zelllinien beobachtet. Zusätzlich konnte in basalen Mammakarzinomzellen eine DKK3-vermittelte Inhibition Progressions-assoziierter Tumorzell-eigenschaften beobachtet werden, die sich in einer modifizierten Zellmorphologie, verbunden mit einer verstärkten Zell-Matrix-Adhäsion, sowie einer reduzierten Zellmigration äußerte. Diese Beobachtungen ließen auf eine mögliche partielle Mesenchymale-Epitheliale-Transition in DKK3-transfizierten Brustkrebszellen schließen, die auf molekularer Ebene durch eine gesteigerte Expression epithelialer Marker, wie E-Cadherin und Claudin 1, sowie einem Verlust des mesenchymalen Transkriptionsfaktors Snail 1 gestützt wurde. Zusammengefasst deuten die im Rahmen dieser Studie generierten Daten auf eine mögliche funktionelle Relevanz eines DKK3-Verlustes insbesondere für die Tumorgenese von Mammakarzinomen des basalen Subtyps hin und könnten als Grundlage für weiterführende Studien, welche die diesen Effekten zugrundeliegenden molekularen Mechanismen im Detail entschlüsseln sollten, dazu beitragen, zielgerichtete Therapien für den schwer therapierbaren basalen Brustkrebs-Subtyp zu entwickeln.Ziel des zweiten Teilvorhabens der vorliegenden Arbeit, das in Kooperation mit dem Lead Discovery Center (LDC) durchgeführt wurde, war die Identifizierung sowie funktionelle Charakterisierung spezifischer Wirkstoffmoleküle, deren Wirkungsspektrum dem des Tumorsuppressor-Proteins SFRP1 entspricht. Diese sogenannten SFRP1-Mimetika sollen der zukünftigen Entwicklung neuartiger Medikamente für die Therapie SFRP1-defizienter Brusttumoren dienen. Zwölf am LDC anhand eines zellulären Primärscreens identifizierte, potentielle SFRP1-Mimetika wurden nachfolgend im Zuge dieser Dissertation mittels weiterer Experimente bezüglich ihrer Wirkung als spezifische Mimetika der SFRP1-Funktion validiert. Basierend auf den Ergebnissen einer initialen Zellwachstums-Analyse, wurden aus diesen zwölf Testsubstanzen vier vielversprechende putative SFRP1-Mimetika für die nachfolgenden funktionellen in vitro-Experimente ausgewählt. Alle vier Testsubstanzen vermittelten eine differenzielle, dosisabhängige Wachstumsinhibition SFRP1-negativer und SFRP1-positiver Brustkrebszellen, mit einem erwartungsgemäß stärkeren Effekt aller Kandidaten auf SFRP1-defiziente Zellen. Darüber hinauskonnte ein dosisabhängiger Einfluss der vier Kandidaten auf die Expression von PCDH10, ein im Zuge einer vorausgegangenen Microarray-Analyse identifiziertes Marker-Gen der SFRP1-Wirkung, beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstützten die Hypothese einer SFRP1-analogen Wirkung dieser vier Wirkstoffmoleküle. Zudem konnten für alle vier putativen SFRP1-Mimetika weitere tumorsuppressive Effekte nachgewiesen werden, die sich in einem verminderten Koloniewachstum, einer erhöhten Apoptoserate sowie einer reduzierten Zellmigration humaner Brustkrebszellen äußerten. Da die Wirkungsprofile der Testsubstanzen jedoch untereinander variierten, sind weiterführende Studien nötig sind, um ihre genauen Wirkmechanismen zu entschlüsseln. Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass es in der vorliegenden Arbeit mit den Substanzen 064, 366, 848 und 994 gelungen ist, vier vielversprechende, putative SFRP1-Mimetika zu identifizieren, die als Ausgangssubstanzen für die Entwicklung neuartiger Medikamente für die Therapie SFRP1-defizienter Mammakarzinome dienen könnten.

The clinical need to develop new drugs for the treatment of human breast cancer is emphasized by the frequent occurrence of resistances against currently used pharmaceuticals as well as a lack of effective targeted therapies, especially for mammary carcinomas of the basal subtype. Targeting of the tumor-promoting WNT signaling pathway activity might represent a promising therapeutic strategy. A deregulation of this pathway is observed in many tumor entities, including breast cancer, and is associated with an unfavorable patient prognosis. Aberrant WNT pathway activation is frequently attributed to an expression loss of its antagonists, including DKK3 and SFRP1.Profound understanding of the molecular alterations underlying the particular subtype-specific breast carcinogenesis is essential for the development of new therapeutic strategies. To contribute to this goal, one aim of the present study was the comprehensive subtype-specific characterization of the putative tumor suppressor DKK3 in human breast cancer. A subtype-specific expression analysis using three independent tissue cohorts (n=30, n=463 and n=791) revealed a significant loss of DKK3 on mRNA and protein level in all clinically relevant breast cancer subtypes compared to healthy breast tissue controls, with the most abundant reduction in basal breast cancer cases respectively. To investigate the molecular mechanisms underlying the differential expression loss observed, a methylation analysis of both transcription-regulating CpG-islands in the DKK3 promoter and its proximal regions was performed using two independent patient cohorts (n=33 and n=497). While methylation in this region was significantly correlated with a loss of DKK3 expression in non-basal cases, basal carcinomas surprisingly presented the lowest methylation frequency indicating a different mechanism of DKK3 inactivation in these tumors. A significant correlation between a low DKK3 mRNA expression and a reduced recurrence-free survival of luminal and basal like breast cancer cases suggested a possible causal involvement of DKK3 in the tumorigenesis of these two breast cancer subtypes. This hypothesis was addressed by performing functional in vitro tests using two luminal and two basal stably transfected gain-of-function breast cancer models. Interestingly, ectopic DKK3 expression resulted in most pronounced effects on cell growth and apoptosis in basal breast cancer cells. In addition, DKK3 reexpression mediated inhibition of progression-associated characteristics of basal breast cancer cell lines resulting in a modified cell morphology, an enhanced cell-matrix adhesion and a reduced cell migration. These observations indicated a possible partial mesenchymal-to-epithelial transition in DKK3-transfected breast cancer cells, supported by an increased expression of epithelial markers like E-Cadherin and Claudin 1 as well as loss of the mesenchymal transcription factor Snail 1. In conclusion, the findings of this study suggest a possible functional involvement of a DKK3 expression loss especially in the tumorigenesis of basal breast cancers. These data provide the basis for future studies investigating the underlying molecular effects of DKK3 in detail and might therefore contribute to the development of targeted therapies for basal breast carcinomas.The second sub-project of the present dissertation was realized in cooperation with the Lead Discovery Center (LDC) in Dortmund. The aim of this study was the identification and functional characterization of specific substances mimicking the tumor suppressive effects of SRFP1. These so called SFRP1-mimetics should conduce to the future development of new drugs for the treatment of SFRP1-deficient breast cancers. The LDC initially identified twelve potential SFRP1-mimetics in a cellular primary screen. In the present study, these candidate substances were further validated in additional experiments regarding their potential SFRP1-analogous effects. Based on the results of an initial cell growth analysis, four promising molecules of these twelve putative SFRP1-mimetics were selected for a subsequent comprehensive functional in vitro analysis. All four candidates exhibited a differential, dose-dependent, growth-inhibitory capacity on SFRP1-negative and SFRP1-positive breast cancer cell culture models, with a pronounced effect on SFRP1-deficient cells. Moreover, all candidate substances influenced the expression of PCDH10, a marker gene of the SFRP1-function identified in a recent microarray analysis, in a dose-dependent manner. These data were in line with a potential SFRP1-analogous mode of action of the candidate molecules. In addition, further tumor-suppressive effects were verified for all four potential SFRP1-mimetics resulting in a decreased colony growth, an increased apoptosis and a reduced cell migration. However, the substances had varying effects on the different tumor cell characteristics analyzed so that further studies are needed to investigate their defined mechanisms of action. In conclusion, four promising, putative SFRP1-mimetics, namely 064, 366, 848 and 994 were identified in the present study that have the potential to be used as initial substances for the development of new drugs for the therapy of SFRP1-deficient mammary carcinomas.

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