Studies on bioprocesses for protein secretion with Corynebacterium glutamicum

Hemmerich, Johannes; Wiechert, Wolfgang; Schwaneberg, Ulrich; Oldiges, Marco

doi:37494

Studies on bioprocesses for protein secretion with Corynebacterium glutamicum

Hemmerich, Johannes^RWTH*

2018

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dipl.-Ing. (FH) Johannes Hemmerich

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (256 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH* ; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-07-17

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-226510
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/729768/files/729768.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/729768/files/729768.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Industrial biotechnology (frei) ; Microbioreactor (frei) ; Process development (frei) ; Quantitative microbial phenotyping (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Nach seiner Entdeckung vor mehr als 60 Jahren ist heutzutage Corynebacterium glutamicum der etablierte Produktionsorganismus für die industrielle Herstellung von Aminosäuren wie L-Glutamat und L-Lysin im Millionen-Tonnen Maßstab. Intensive grundlegende und angewandte Forschung, die immer noch andauert, war und ist eine treibende Kraft für diese Erfolgsgeschichte der Biotechnologie. Aktuell rückt C. glutamicum in den Fokus als Produktionsorganismus für die Herstellung von heterologen Proteinen, die für technische und klinische Anwendungen interessant sind. Als Konsequenz richtet sich die Forschung hin zur Anwendung von C. glutamicum als mikrobielle Zellfabrik für die Proteinproduktion. Mikrobioreaktor (MBR) Systeme sind wertvolle Werkzeuge für die schnelle und zuverlässige Charakterisierung von neuen, mittels metabolic engineering konstruierten Stammvarianten. MBR Systeme bieten einen erhöhten experimentellen Durchsatz bei gleichzeitiger Kontrolle von Kultivierungsparametern, sowie die Möglichkeit der Aufzeichnung von Kultivierungsdynamiken. In dieser Arbeit wurden verbesserte Anwendungsmethoden für MBR Systeme entwickelt, zugeschnitten auf die Anforderungen, die sich ergeben bei der quantitativen Phänotypisierung von C. glutamicum Stämmen, welche das green fluorescent protein (GFP) und Cutinase als Modellprotein sekretieren. Die Arbeiten erstrecken sich dabei über die sorgfältige Auswahl von Standardarbeitsbedingungen in Bezug auf physiologische Anforderungen wie die Sauerstoff-unlimitierte Metabolisierung von Glukose, sowie die Bestimmung von Genauigkeit und Präzision der online Biomassemessung. Darüber hinaus wird eine Methode präsentiert, welche es erlaubt, zeitlich aufgelöste Konzentrationsänderungen von sekretiertem Protein und Substrat zu bestimmen, ohne dass dies mit einem Verlust an experimentellem Durchsatz einhergeht. Die Notwendigkeit von (halb-) automatischer Datenprozessierung aus Hochdurchsatzkultivierungen in MBR Systemen wird diskutiert anhand abgeleiteter Performance-Indikatoren (PI). Diese stellen kondensierte Maßzahlen für die schnelle Evaluierung der gesamten Kultivierung dar. Als konkretes Anwendungsbeispiel wird eine Methode für die automatisierte Bestimmung der spezifischen Wachstumsrate detailliert beschrieben, denn dieser PI ist mutmaßlich die am häufigsten herangezogene Charakteristik bei der Testung von Mutantenbibliotheken hinsichtlich biologischer Fitness. Des Weiteren wird anhand des Beispiels der Maximierung des extrazellulären GFP Titers gezeigt wie sich MBR Systeme, die Integration von Laborrobotern und Kriging-basierte Planung und Auswertung von Experimenten in synergistischer Weise ergänzen. Als Ergebnis wird ein iterativer Arbeitsablauf präsentiert, der als Blaupause für die Entwicklung von weiteren biotechnologischen Anwendungen dienen kann. Unerwarteterweise konnte der sekretierte GFP Titer verdoppelt werden, was zeigt, dass routinemäßig angewandte Nährmedien, welche für die Aminosäureproduktion mit C. glutamicum entwickelt wurde, für andere Optimierungsziele sorgfältig angepasst werden müssen. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersucht den Einfluss des bisher nicht untersuchten Zusammenhangs zwischen Bioprozesskontrolle und Wahl des Signalpeptides auf die Cutinasesekretionsleistung mit C. glutamicum. Da der gewünschte Umfang an Bioprozesskontrolle im verwendeten MBR System nicht zur Verfügung steht, wurde ein konsistenter Datensatz aus über 150 Bioreaktorkultivierungen im Labormaßstab generiert. Die Diskussion und Interpretation der gewonnenen Daten erfolgt unter dem Gesichtspunkt verschiedener Optimierungsziele. Als ein typisches Anwendungsbeispiel für MBR Systeme ist die quantitative Phänotypisierung einer Bibliothek von Genom-reduzierten C. glutamicum Stämmen für die sekretorische Produktion von Cutinase gezeigt. Es wurden vielschichtige Datensätze erhoben, welche Wachstumsraten und Cutinaseausbeuten als extrazelluläre Phänotypen umfassen, sowie die detaillierte Analyse von Transkriptom und Proteom als intrazelluläre Phänotypen für ausgesuchte Stammvarianten. Neben überraschenden phänotypischen Ausprägungen für verschiedene genomische Deletionen, sowie differentiellen Analysen von Genotypen mit überlappenden Deletionen zwischen verschiedenen Stämmen, werden Erklärungsversuche geliefert, welche mögliche metabolische Zustände als Folge von als signifikant erkannten Änderungen im Proteom beschreiben. Des Weiteren wurden die gesammelten Daten zu extrazellulären Phänotypen in einem Daten-getriebenen, rein phänomenologischen Regressionsansatz mit Dummyvariablen genutzt zur Ermittlung eines minimal reduzierten Genoms, welches mit einer erhöhten Cutinaseausbeute einhergehen sollte. Schließlich werden einige Aspekte über die Zielsetzung dieser Arbeit hinaus als Ausblick gegeben. Dies umfasst die Anwendung von C. glutamicum als potentiellen alternativen Organismus für die Produktion heterologer Proteine und zukünftige Erfordernisse in der Weiterentwicklung von MBR Systemen. Die Notwendigkeit von Lösungsansätzen für die Verwaltung, (Re-)Prozessierung und Interpretation von kontinuierlich wachsenden heterogenen Datenströmen wird angesprochen, da es abzusehen ist, dass sich der Output von Daten aus der Kombination von Hochdurchsatzkultivierung und leistungsstarken analytischen Methoden stark erhöhen wird und diesem begegnet werden muss.

After being discovered 60 years ago, Corynebacterium glutamicum is a major industrial workhorse for the production of amino acids like L-glutamate and L-lysine at several million tons per year. Intense and still ongoing basic and applied research fueled this great biotechnological success story. Currently, C. glutamicum is increasingly getting into focus as production host for heterologous proteins of both technical and clinical interest. Consequently, research is shifting towards the use of C. glutamicum microbial cell factory for protein production.To facilitate rapid and reliable characterization of newly constructed strain variants from metabolic engineering, microbioreactor (MBR) systems emerged as versatile tools. Such systems provide an increased experimental throughput with the ability to control environmental cultivation parameters, as well as monitoring of culture dynamics like biomass formation. In this study, methods for MBR systems are developed to suite the demands of a specific screening objective, namely the quantitative phenotyping of C. glutamicum strains secreting green fluorescent protein (GFP) and cutinase as heterologous model proteins. This involves the careful selection of standard operating conditions with respect to physiological demands like oxygen-unlimited metabolization of glucose as main carbon source, as well as determination of accuracy and imprecision of online biomass monitoring. Furthermore, to obtain time-resolved data on secretory protein formation and substrate consumption, an improved method is presented and validated that does not accompany a loss in MBR cultivation throughput. The need for (semi-)automated data processing from high-throughput MBR cultivations is also discussed on the example of derived performance indicators (PIs) that represent condensed evaluation metrics for rapid evaluation of whole cultivation experiments. As application example, a method for automated growth rate determination is presented in detail, since this PI is probably the most often applied characteristic in biological fitness testing of mutant strain libraries. In addition, on the example of maximizing secreted GFP titer, it is shown how MBR systems, integration of laboratory automation and Kriging-based Design of Experiments (DoE) complement each other in a synergistic way. As a result, an iterative workflow is presented that serves as blueprint for development of further biotechnological applications. Unexpectedly, secreted GFP titer could be doubled, showing that routinely applied nutrition media designed for amino acid production with C. glutamicum need to be carefully adapted and optimized with changing screening objectives, that is here secretion of heterologous proteins. To complement the current knowledge on how to select the optimal signal peptide (SP) for different expression hosts and different target proteins of choice, the interrelation of bioprocess control strategy and choice of SP to optimize cutinase secretion with C. glutamicum is investigated in detail. Since the envisaged degree of process control could not be realized with the available MBR systems, a consistent data set was generated relying on more than 150 bench scale bioreactor runs. Furthermore, the results are discussed and interpreted in the light of changing bioprocess optimization objectives, which again highlights the need for careful definition of optimization objectives. Representing a typical application example of MBR systems, the quantitative microbial phenotyping of a library of genome reduced C. glutamicum strains for heterologous cutinase secretion was conducted. The collected data comprise growth rates and cutinase yields as extracellular phenotypes, as well as detailed analysis at the transcriptome and proteome level for a small subset of strains. Next to surprising phenotypes due to specific genomic deletions, as well as differential analysis of phenotypes from strains with overlapping genomic deletions, attempts were made to explain the metabolic perturbations from observed significantly differential regulation at the protein level. Also, by incorporating all data on extracellular phenotypes, a data-driven, phenomenological multiple regression approach was used to identify the minimum set of genomic deletions needed in terms of improved cutinase secretion. Finally, a few future aspects outreaching the scope of this work are presented as outlook. These aspects concern the application of C. glutamicum as potential alternative host for heterologous protein production, the demand for further development of microbioreactor systems and the need for smart solutions for warehousing, (re-)processing and interpretation of heterogeneous data sets to cope with the foreseeable increase of information output generated from high-throughput experimentation in combination with powerful analytical methods.

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