AREG contributes to the diminished PICD of neonatal monocytes by EGFR-mediated apoptosis suppression

Platen, Christopher; Orlikowsky, Thorsten; Usadel, Björn; Bohrmann, Johannes

doi:37807

AREG contributes to the diminished PICD of neonatal monocytes by EGFR-mediated apoptosis suppression

Platen, Christopher^RWTH*

2018 & 2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Christopher Platen, M.Sc. Biotechnologie

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (XII, 96 Seiten, Seite XIII-LIII)

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Orlikowsky, Thorsten (Thesis advisor)^RWTH* ; Usadel, Björn (Thesis advisor)^RWTH* ; Bohrmann, Johannes (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-11-26

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-231215
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/751263/files/751263.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
AREG (frei) ; Amphiregulin (frei) ; CBMC (frei) ; CBMO (frei) ; EGFR (frei) ; Infection (frei) ; Infectious diseases (frei) ; Inflammation (frei) ; Monocytes (frei) ; Neonatal (frei) ; PBMC (frei) ; PBMO (frei) ; PICD (frei) ; Phagocytosis-Induced Cell Death (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Fast eine Millionen Neugeborene sterben jährlich an Infektionskrankheiten, was unter anderem auf die vermehrte Anfälligkeit für mikrobielle Infektionen aufgrund massiver Unterschiede zum adulten Immunsystem zurückzuführen ist. Der Prozess der Inflammation ist ein natürlicher Schutzmechanismus bei Infektionen oder Verletzungen. Dabei ist die Termination des Prozesses essentiell, da eine anhaltende Inflammation mit der kontinuierlichen Ausschüttung von Zytokinen einhergeht und zu Gewebeschäden, Funktionsstörungen der Organe sowie einer erhöhten Mortalität führen kann. Das pathologische Andauern der Inflammation ist insbesondere für Neugeborene von zentraler Bedeutung, da diverse neonatale Erkrankungen, wie periventrikuläre Leukomalazie, nekrotisierende Enterokolitis oder bronchopulmonale Dysplasie, durch eine prolongierte inflammatorische Antwort gekennzeichnet sind. Ein physiologischer Vorgang, der Länge und Umfang der inflammatorischen Antwort reguliert, ist die Apoptoseinduktion von inflammatorischen Effektorzellen. Ein spezielles Beispiel ist der Phagozytose-induzierte Zelltod (phagocytosis-induced cell death, PICD) von phagozytierenden Immunzellen. Frühere Studien belegen, dass der PICD in neonatalen Monozyten, im Vergleich zu adulten Monozyten, deutlich reduziert ist. Ein potentieller therapeutischer Ansatz wäre, die anhaltende Inflammation in Neonaten durch einen Anstieg des verringerten PICD zu begrenzen. Ein Rezeptor, der nach Bindung seines Liganden die Induktion der Apoptose blockieren kann, ist der EGF Rezeptor. Ein Ligand des EGFR ist das Zytokin Amphiregulin (AREG). Da verschiedene Studien zeigen, dass AREG Apoptoseresistenz vermittelt und zudem bei bakterieller Infektion sezerniert wird, wurde die Hypothese aufgestellt, dass AREG zum verringerten PICD von neonatalen Monozyten durch Beeinflussung der Apoptose-Signalkaskade beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein etabliertes in vitro E. coli Infektionsmodell genutzt, um den PICD in primären Monozyten aus peripherem Blut (PBMO) und Nabelschnurblut (CBMO) zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CBMO nach Infektion eine deutlich erhöhte pro-AREG Expression an der Zelloberfläche, sowie höhere Konzentrationen des löslichen Proteins freisetzen, die als anti-apoptotischer Stimulus dienen könnten. Mithilfe durchflusszytometrischer Analysen wurde sowohl der intrinsische als auch der extrinsische Apoptose-Signalweg in Abhängigkeit von AREG untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass AREG beide Signalwege über den EGFR reguliert. Die extrinsische Apoptose wird von AREG über die Erhöhung der intrazellulären Matrixmetalloproteasen MMP-2 und -9 reguliert, die die proteolytische Spaltung des membranständigem Fas Liganden bewirken. Im Falle der intrinsischen Apoptose führt die Bindung von AREG an den EGFR zur Phosphorylierung von ERK1/2, Akt und BAD. Diese hat sowohl eine Erhöhung der intrazellulären Bcl-2 und Bcl-XL Proteinkonzentration, als auch eine verminderte Aktivierung der Pro-Caspasen -9 und -3 zur Folge. Weiterhin zeigen die Daten, dass AREG einen regulatorischen Einfluss auf T-Zellen haben könnte, ein Zelltyp, der für die Immunantwort von elementarer Bedeutung ist. AREG verringert die Proliferation von T-Zellen vermutlich über die kostimulatorische Kapazität von Monozyten, indem es die Oberflächenexpression von CD80, CD86 und HLA-DR reduziert. Die temporäre Präsenz während der Neonatalperiode könnte AREG als endogenen Immunregulator identifizieren. Die Untersuchung zugrundeliegender Mechanismen von inflammatorischen Erkrankungen in Neugeborenen ist von wesentlichem klinischen Interessen und ein besseres Verständnis der regulatorischen Elemente, die den PICD beeinflussen, könnte die Entwicklung neuer Therapieansätze erleichtern. Durch Inhibition von AREG konnte der PICD von neonatalen Monozyten signifikant erhöht werden, womit AREG ein potentielles Zielprotein darstellen könnte, um den Verlauf von inflammatorischen Krankheiten in Neugeborenen zu beeinflussen.

Neonates are highly susceptible to microbial infections, resulting in nearly 1 million neonatal deaths per year. This predisposition is particularly referable to distinct differences between the immune system of adults and neonates. The process of inflammation is usually triggered as a protective response to infection or tissue injury. The accurate resolution of the inflammatory response is essential to return to tissue homeostasis since a prolonged inflammation with ongoing cytokine release can result in tissue damage, organ dysfunctions and mortality. This is of particular importance for newborns, since various neonatal diseases, including periventricular leukomalacia, necrotizing enterocolitis or bronchopulmonary dysplasia, are characterized by sustained inflammation. One factor known to control length and extent of the inflammatory response, is the regulation of effector cell apoptosis. A special type of apoptosis is the phagocytosis-induced cell death (PICD) of phagocytic immune cells. Previous studies demonstrated that PICD is less frequently triggered in neonatal monocytes than in adult monocytes. Hence, a rescue of monocyte PICD could be a potential therapeutic approach to target the sustained inflammation in neonates. The EGF receptor is capable of blocking the initiation of apoptosis upon activation by its specific ligands. One ligand is the cytokine amphiregulin (AREG), which is increasingly shedded in response to bacterial infection and was shown to mediate apoptosis resistance. Therefore, it was hypothesized that AREG might contribute to the reduced PICD of neonatal monocytes by affecting the apoptosis signaling of monocytes. In this study, a well-established in vitro E. coli infection model was used to analyze PICD in primary monocytes from peripheral (PBMO) or cord blood (CBMO). The results indicate that CBMO show remarkably higher AREG surface expression as well as soluble levels in response to infection which could function as anti-apoptotic stimulus. Flow cytometry experiments were conducted to analyze intrinsic and extrinsic apoptosis signaling in dependence on AREG. Strikingly, AREG was proven to affect both pathways through EGFR downstream trafficking. With regard to extrinsic apoptosis, AREG increases intracellular MMP-2 and MMP-9 levels through EGFR activation, whereby inducing cleavage of membrane-bound FasL. Intrinsic apoptosis signaling is supressed by AREG function via EGFR-mediated phosphorylation of ERK1/2, Akt and BAD, resulting in increased intracellular Bcl-2 and Bcl-XL levels and decreased cleavage of pro-caspase-9 and -3. Furthermore, the results indicate that AREG may have regulatory function on T cells, which are of special importance for the immune response as they perform key effector functions during inflammation. AREG potentially reduces T cell proliferation through the suppressed costimulatory capacity of monocytes, since surface expression of CD80, CD86 und HLA-DR was found downregulated. The temporary presence during the newborn period might identify AREG as endogenous immune regulator. Targeting inflammatory diseases in neonates is of central clinical relevance and a better understanding of the regulatory elements involved in PICD could be essential to find new therapeutic strategies. Inhibition of AREG rescued the PICD of neonatal monocytes, thereby identifying AREG as potential target to reduce sustained inflammation in neonates.

OpenAccess:
PDF
(additional files)