Triple helix-targeted DNA methylation with DNA methyltransferase-oligodeoxynucleotide conjugates

Giesbertz, Anna; Kiss, Antal; Weinhold, Elmar

doi:HT019934997

Triple helix-targeted DNA methylation with DNA methyltransferase-oligodeoxynucleotide conjugates = Tripelhelix-gesteuerte DNA Methylierung mit DNA Methyltransferase-Oligodesoxynukleotidkonjugate

Giesbertz, Anna^RWTH*

2018 & 2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anna Giesbertz (M.Sc.)

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (VII, 104 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Kiss, Antal (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-11-09

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-00264
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/752832/files/752832.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
C5-DNA methyltransferases (frei) ; SNAP-tag technology (frei) ; protein-DNA conjugates (frei) ; targeted DNA methylation (frei) ; triple helix formation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene prokaryotische DNA Methyltransferasen (MTasen) mit der CpG-Erkennungssequenz jeweils mit einem Tripelhelix-bildenden Oligodesoxynukleotid (TFO) gekuppelt. Die hergestellten Konstrukte dienten zur spezifischen Methylierung eines CpGs innerhalb der Promoterregion des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (EpCAM). Die Überexprimierung von EpCAM wurde in vielen Karzinomen gefunden und korreliert mit dem Methylierungsstatus in der Promoterregion (van der Gun et al., 2008). SNAP-tag Fusionsproteine von M.SssI, M.MpeI und M.MpeI(Q142L) wurden mittels SNAP-tag Technologie mit dem Benzyl-Kohlenstoff eines parasubstituierten Benzylguanins (BG) verbunden. Dazu erfolgte zunächst die BG-Modifikation des TFOs in zwei Schritten, bei denen BG-PEG35-TFO mit einer Gesamtausbeute von 65% erhalten wurde. Bei der Aufreinigung von M.SssI-TFO konnte das restliche BG-PEG35-TFO nicht von dem Produkt abgetrennt werden und M.SssI-TFO wurde daher nicht weiter untersucht. Die Konjugate M.MpeI-TFO und M.MpeI(Q142L)-TFO wurden mit einer Ausbeute von 55% beziehungsweise 16% erhalten. Die Spezifität von M.MpeI-TFO wurde in vitro in einem Modifikations-Restriktionsassay mit Litcon54 DNA getestet. Das Plasmid Litcon54 wurde dazu so entworfen, dass das TFO in der Nähe des addressierten CpGs bindet. Als Kontrolle diente Litcon47, ein vergleichbares Plasmid bei dem das TFO nicht die Möglichkeit hat an das Plasmid zu binden. Durch Inkubation mit der CpG Methylierungssensitiven Restriktionsendunuklease R.Psp1406I, wurde der Methylierungsstatus der geforderten CpGs überprüft. Die Spezifität wurde mit supercoiled, open-circular und linearem Plasmid getestet und bei allen drei Formen konnte spezifische Methylierung des addressierten CpGs festgestellt werden. Nichtspezifische Methylierung wurde auch beobachtet und stammte von entweder gebundenem oder ungebundenem M.MpeI-TFO. Nichtspezifische Methylierung durch gebundenes M.MpeI-TFO konnte im linearen Plasmid unterdrückt werden, was zu einer höheren spezifischen Methylierung des addressierten CpGs führte. Preinkubation von M.MpeI-TFO mit linearem Litcon54 hatte keinen Effekt auf die Spezifität. Höhere NaCl-Konzentrationen im Reaktionspuffer verringerten die DNA Bindungsaffinität von M.MpeI, aber vermutlich auch die Stabilität der Tripelhelix, sodass die Spezifität nicht erhöht wurde. Die höchste spezifische Methylierung des addressierten CpGs wurde mit 20 eq. M.MpeI(Q142L)-TFO und linearem Litcon54 erreicht. Zum einen führte die Verwendung des linearen Plasmids zur Unterdrückung nichtspezifischer Methylierung durch gebundenes Konjugat. Zum anderen führte die geringere DNA Bindungsaffinität der DNA MTase zu einer minimalen nichtspezifischen Methylierung durch ungebundenes Konjugat.

In this work, three bacterial DNA methyltransferases (MTases), that methylate cytosine within the CpG recognition sequence, were coupled to a triple helix-forming oligodeoxynucleotide (TFO) to create constructs for targeted DNA methylation. The constructs were designed to target and methylate a single CpG site located in the promoter region of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), of which the overexpression has been found in many carcinomas and is correlated to the methylation status within the promoter region (van der Gun et al., 2008). The coupling strategy was based on the SNAP-tag technology, with which the benzylic carbon of a para-substituted benzylguanine (BG) is connected to a variant of O6-alkylguanine DNA alkyltransferase (hAGT) that is fused with a DNA MTase. The BG modification of the TFO occurred in two steps and BG-PEG35-TFO was obtained with an overall yield of 65%. SNAP-tag fusion proteins of M.SssI, M.MpeI and the low DNA affinity mutant M.MpeI(Q142L) were then coupled to the BG-modified TFO. The purification of M.SssI-TFO by anion exchange chromatography proved to be challenging and the product that was obtained with a yield of less than 5% was contaminated with BG-PEG35-TFO, which could not be removed from the product. M.SssI-TFO was therefore not further investigated. The conjugates M.MpeI-TFO and M.MpeI(Q142L)-TFO could be purified by anion exchange chromatography with a yield of 55% and 16%, respectively. The DNA methylation specificity of M.MpeI-TFO was tested in vitro with a modification-restriction assay using Litcon54 DNA, a plasmid that was designed for the TFO to bind near a CpG site, and Litcon47, a similar plasmid lacking the triple helix-forming site (TFS). The methylation status of the challenged CpG sites was verified by incubation with the CpG methylation-sensitive restriction endonuclease R.Psp1406I. The experiment was carried out on supercoiled, open-circular, and linear plasmid. Specificity towards the target site was observed with all three forms of Litcon54. Non-specific methylation was also observed and derived from methylation by both unbound and bound M.MpeI-TFO. The latter could be suppressed in linear Litcon54, which led to a higher specificity towards the target site compared to the supercoiled and open-circular forms. Preincubation of M.MpeI-TFO with linear Litcon54 did not affect the specificity. Higher amounts of NaCl in the reaction buffer, that would decrease the affinity of M.MpeI-TFO with the DNA, possibly also reduced the stability of the triple helix and therefore did not increase the specificity towards the targeted site. The highest specificity towards the targeted site was achieved with 20 eq. of M.MpeI(Q142L)-TFO and linear Litcon54. Not only was non-specific methylation by bound conjugate suppressed due to the use of linear plasmid, but also the reduced DNA binding affinity of the DNA MTase led to minimal non-specific methylation by free M.MpeI(Q142L)-TFO.

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