Regulation of KUA1 and KUA2 transcriptional activity during leaf expansion in Arabidopsis thaliana

Kunkowska, Alicja Barbara; van Dongen, Joost Thomas; Slusarenko, Alan

doi:10.18154/RWTH-2019-06552

Regulation of KUA1 and KUA2 transcriptional activity during leaf expansion in Arabidopsis thaliana

Kunkowska, Alicja Barbara^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Alicja Barbara Kunkowska, M.Sc.

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (152 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor)^RWTH* ; Slusarenko, Alan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-07-04

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-06552
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/763926/files/763926.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
ROS (frei) ; leaf expansion (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Kenntnis über das Blattwachstum in Pflanzen ist ein notwendiger Bestandteil für die Verbesserung der Getreideproduktion. Das Blattwachstum beginnt mit einer Population undifferenzierter Zellen, welche die endgültige Organgröße durch Zellproliferation und -wachstum bestimmen. Obwohl beide Zelldifferenzierungsprozesse strikter genetischer Kontrolle unterliegen, ist über die Transkriptionellen Netzwerke wenig bekannt. In vorausgehenden Studien wurden die Myb-ähnlichen Transkriptionsfaktoren KUODA1 (KUA1) und KUODA2 (KUA2) als spezifische Regulatoren der Zell-expansion während es Blattwachstums durch Repression von class III Peroxidasen (POXs) identifiziert. Mitglieder dieser Klasse von POXs werden sekretiert und lokalisieren an der Zellwand, wo sie die Homöostase der Reaktiven Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species, ROS) modulieren, da POX Enzyme ROS sowohl produzieren als auch abbauen können. Die Synthese von Sauerstoffperoxid (H2O2) bedingt die Verhärtung der Zellwand und beschränkt so die Zellexpansion, während die Umwandlung von H2O2 in das Hydroxyl-Radikal OH• die Lockerung der Zellwand bewirkt, welches die Zellexpansion ermöglicht. Durch KUA1 reprimierte POXs erhöhen die apoplastische Konzentation von H2O2, so dass KUA1 als Positiv-Regulator der Zellexpansion im Blatt angesehen werden kann. Allerdings ist über die molekularen Mechanismen der Transkriptionellen Repression durch KUA1 und KUA2 nichts bekannt. In der hier vorgelegten Studie wurde gezeigt, dass KUA1 und KUA2 über K/MLFGV und EAR Domänen mit Mitgliedern der TOPLESS/TOPLESS-RELATED (TPL/TPR) Co-Repressoren interagieren. Mit Hilfe von Studien mit transgenen Arabidopsis-Linien konnte gezeigt werden, dass sich der Zellexpansions-Phänotyp in tpl-Mutantenlinien Komplementär zum Phänotyp von kua1- und kua2-Mutantenlinien verhält. Im Gegensatz dazu waren tpr2- und tpr4-Linien in der Zellproliferation gestört. Interessanterweise zeigten tpl tpr2 und tpl tpr4 Doppel-Mutantenlinien einen verstärkten Phänotyp, was darauf hindeutet dass TPL/TPR-Proteine nur partiell redundant agieren in der Kontrolle der Zellproliferation und -expansion. Durch Chromatin-Immunopräzipitations-Experimente konnte des Weiteren demonstriert werden, dass TPR2- und TPR4-Proteine mit Promotoren assoziieren, welche von KUA1 reguliert werden. Zudem wurden sowohl durch chemische Inhibition von POX-Enzymen als auch durch Visualisierung von H2O2 gezeigt, dass TPL/TPR-Proteine womöglich die Aktivität von class III POX-Enzymen modulieren. Außerdem wurde heraus gefunden, dass CHE Transkriptionsfaktoren, welche zur TCP-Familie gehören, mit KUA2 interagieren. Obwohl Transaktivator-Assays in Abwesenheit von CHE zu einer stark reduzierten Repressor-Aktivität von KUA2 geführt haben, wurde ein bemerkenswerter antagonistischer Effekt auf die Zellexpansion im Vergleich mit KUA2 festgestellt. Schließlich wurden potentielle Zielgene des CHE Transkriptionsfaktors mittels RNA-Seq einer Estradiol-induzierbaren Überexpressionslinie im Vergleich mit dem Wildtyp identifiziert: hier waren 46 Gene in ihrer Expression hochreguliert und 19 Gene herunterreguliert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit demonstriert werden konnte, das die Blattwachstums-regulierenden Myb-ähnlichen Transkriptionsfaktoren KUA1 und KUA2 mit den TPL/TPR Co-Repressoren interagieren und diese womöglich gemeinsam die Zellexpansion regulieren. Zudem wurde heraus gefunden, dass der Transkriptionsfaktor CHE mit KUA2 interagiert und des Weiteren notwendig ist, damit KUA2 seine molekulare regulatorische Funktion ausüben kann.

Understanding the mechanisms of leaf growth is vital for the improvement of crop production. Leaf growth begins with an undifferentiated population of cells, which through proliferation and expansion determine final organ size. Although both processes underlie strict genetic control, specific transcriptional networks have remained elusive. Previously, the Myb-like transcription factors KUODA1 (KUA1) and KUODA2 (KUA2) were identified as specific regulators of cell expansion during leaf growth by direct repression of class III peroxidases (POXs). Members of this class are secreted to the cell wall where they produce and break down reactive oxygen species (ROS). The formation of hydrogen peroxide (H2O2) causes stiffening of the cell wall, restricting cell expansion. The H2O2-derived hydroxyl radical causes cell wall loosening, thus promoting cell expansion. KUA1-regulated POXs increase apoplastic H2O2 levels; therefore, KUA1 positively regulates leaf cell expansion by maintaining low levels of H2O2 in the apoplast. However, the molecular mechanism through which KUA1 and KUA2 act as transcriptional repressors remain unknown. The here presented study shows that Arabidopsis thaliana KUA1 and KUA2 interact through K/MLFGV and EAR domains with members of the TOPLESS/TOPLESS-RELATED (TPL/TPR) co-repressor family. Employment of transgenic approaches revealed that the tpl cell expansion phenotype was complementary to kua1 and kua2, while tpr2 and tpr4 mutants were affected cell proliferation. Interestingly, tpl_tpr2 and tpl_tpr4 double mutants displayed enhanced phenotypes, suggesting that all TPL/TPR proteins control cell proliferation and expansion. By using ChIP assays it was demonstrated that TPR2 and TPR4 associated with the promoters of KUA1 target genes. Moreover, the combinatory approach of chemical inhibition of POX enzymes and H2O2 visualization revealed that the TPL/TPR proteins may modulate the activity of class III POXs. In addition, the CHE transcription factor, a member of the TCP family, was found to interact with KUA2. Although transactivation assays revealed that KUA2 repressor activity was strongly reduced in the absence of CHE, remarkably CHE displayed an antagonistic effect on cell expansion to KUA2. Finally, the potential target genes of CHE were identified with an RNA-Seq approach. The preliminary analysis of the data uncovered 46 up- and 19 down-regulated genes in the CHE estradiol-inducible overexpression line as compared to wild type. Taken together, the here presented work demonstrates that the leaf growth-regulating Myb-like transcription factors KUA1 and KUA2 interact with TPL/TPR co-repressors, and that they might regulate cell expansion together. In addition, CHE interacts with KUA2 and is required for KUA2 to fully exert its regulatory function.

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