Isolierung und Identifikation von G-Quadruplex-DNA-bindenden Proteinen

Rauser, Valerie Christine; Albrecht, Markus; Weinhold, Elmar

doi:38384

Isolierung und Identifikation von G-Quadruplex-DNA-bindenden Proteinen = Isolation and identification of G-Quadruplex DNA-binding proteins

Rauser, Valerie Christine^RWTH*

2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Valerie Christine Rauser (M.Sc. RWTH)

ImpressumAachen 2019

Umfang1 Online-Ressource (VIII, 158 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)^RWTH* ; Albrecht, Markus (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-06-18

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-06785
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/764356/files/764356.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Innerhalb dieser Arbeit wurden Fortschritte auf dem Gebiet der Isolierung und Identifikation von Proteinen erzielt, die an die biologisch relevante, G-Quadruplex-bildende DNA-Sequenz aus dem Promotor des Onkogens c-myc binden. Hierzu wurde eine neue Methode entwickelt, um die polymorphen Strukturen der Guanin-reichen Sequenz Pu27 aus dem c-myc-Promotor in eine definierte, monomere G4-Struktur zu überführen. Durch die Behandlung mit 150 mM NaOH bei Raumtemperatur wurden alle Multimere zuverlässig denaturiert und bei Renaturierung mit einem Überschuss von K+-haltigem Puffer ausschließlich das gewünschte G4-Monomer mit paralleler Orientierung erhalten. Der Erfolg dieser Methode konnte anhand von SEC-Analysen, Gelelektrophorese, CD-Spektroskopie und UV-Schmelzkurven neben der Pu27-Sequenz auch für verwandte DNA-Sequenzen bestätigt werden. Für die Isolierung von G4-DNA-bindenden Proteinen aus Zelllysat wurde die zuvor geformte, biotinylierte G4-DNA auf Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln immobilisiert. Neben der G4-Sequenz Pu27 und deren Derivat Myc22 wurden als Kontrolle Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA genutzt und die Proteine auf eine Verdrängbarkeit durch den G4-bindenden Liganden PhenDC3 untersucht. Dabei wurde in der Analyse mittels SDS-PAGE deutlich, dass an Pu27 und Myc22 sehr viele Proteine binden, die in den Kontrollen mit Einzelstrang- und Doppelstrang DNA nicht zu finden sind. Umgekehrt konnten mit diesen DNA-Strukturen wiederum Proteine isoliert werden, die nicht an G4-DNA binden und wiederum andere Proteine waren in allen Proben zu finden. Durch PhenDC3 konnten viele der G4-bindenden Proteine verdrängt werden. Zur Identifikation der isolierten Proteine wurden die Proben mittels Massenspektrometrie in Zusammenarbeit mit dem Institut Curie in Paris, Frankreich, analysiert und anhand einer humanen Datenbank zugeordnet. Zum Herausfiltern der relevanten Zielproteine wurde zuerst analysiert, welche Proteine eine hohe Affinität zu den G4-Sequenzen haben im Vergleich zu der Kontroll-DNA. Im zweiten Schritt wurden die Proteine, die dort gute Werte erzielten, auf ihre Verdrängbarkeit mit PhenDC3 untersucht. Als Zielproteine gelten alle Proteine, die zum einen gute Bindungseigenschaften zu den untersuchten G4-Sequenzen besitzen und sich zum anderen gut mit PhenDC3 verdrängen lassen. Auf diese Weise konnten insgesamt 28 Zielproteine ermittelt werden. Anschließend wurde die Affinität von aufgereinigten Zielproteinen an verschiedene DNA-Strukturen untersucht. Dabei gelang es, die Bindung von ersten Zielproteinen an die G4-DNA zu verifizieren und YBX1 und hnRNP U wurden als besonders vielversprechend identifiziert. Somit ist es gelungen, aus der polymorphen c-myc-Promotor-Sequenz in vitro eine biologisch relevante, monomere G4-Struktur zu formen und diese zur Isolierung von Proteinen aus humanen Krebszellen zu nutzen. Diese Zielproteine konnten identifiziert und die Bindung validiert werden, wodurch eine weiterführende Untersuchung der biologischen Funktion ermöglicht wird.

In this work, progress was made in the subject of protein isolation and identification, which bind to the biologic relevant G-quadruplex forming DNA sequence derived from the promotor of the onkogen c-myc. Development of a new methodology enabled the transformation of the polymorphic structure of the guanine-rich sequence Pu27 of the c-myc promotor to a monomeric G4 structure. Multimers were denaturized by treatment with 150 mM NaOH at room temperature. Renaturization in presence of excessive amount of K+¬-buffer lead to a selective formation of the desired parallel oriented G4-monomer. The successful application of this method could be confirmed by SEC-analyses, gel electrophoresis, CD spectroscopy and UV-melting curves for the Pu27 sequence as well as related DNA sequences. The monomerized and biotinylized G4 DNA was immobilized on streptavidin coated magnetic beads for the isolation of the G4 binding proteins from cell lysate. Beside Pu27 and its derivative Myc22, single- and double-stranded DNA was tested as control sequence. Furthermore, the displaceability of the proteins was evaluated by treatment with the G4-binding ligand PhenDC3. Analysis via SDS-PAGE showed a selective binding of many proteins to the Pu27 and Myc22 sequence, which showed no affinity for the single- and double-stranded control sequence. On the other hand, those DNA structures enabled the isolation of non-G4-binding DNA. Other proteins could be found in all samples. Many of the G4-binding proteins could be displaced by PhenDC3. For identification of the isolated proteins, the generated samples were analyzed via mass spectrometry and assigned based on a human database in collaboration with the Institute Curie in Paris, France. Analysis of the protein affinity to G4-sequence in comparison to the control sequence enabled the selection of the relevant target proteins. In a second step, the promising proteins examined regarding the displaceability with PhenDC3. Proteins with a good binding property to the examined G4-sequence as well as a good displaceability with PhenDC3 are defined as target protein. 28 target proteins meeting those criteria could be identified via this method. Next, the affinity of purified target proteins to different DNA structures was examined. Within this study, binding of identified target proteins to G4 DNA was verified and the proteins YBX1 and hnRNP U were identified as promising candidates. Alltogether, a biologic relevant, monomeric G4-structure derived from the polymorphic c-myc promotor was formed in vitro. This G4 could be utilized for the isolation of proteins from humane cancer cells. Those target proteins have been identified and their binding selectivity was validated, which enables further investigations of their biologic function.

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