Investigating the metabolism of Pichia pastoris for improved recombinant protein production

Förster, Jan; Blank, Lars M.; Oldiges, Marco

doi:HT020283447

Investigating the metabolism of Pichia pastoris for improved recombinant protein production = Die Erforschung des Metabolismus von Pichia pastoris zur Verbesserung der rekombinanten Proteinproduktion

Förster, Jan^RWTH*

2019

VerantwortlichkeitsangabeJan Förster

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2019

Umfang1 Online-Ressource (XIII, 172 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ReiheApplied microbiology ; 15

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2019-05-22

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2019-10507
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/771961/files/771961.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
glycosylation (frei) ; metabolism (frei) ; pastoris (frei) ; pichia (frei) ; protein production (frei) ; recombinant (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Aufgrund der stetig steigenden Nachfrage nach Proteinen rücken die zur Produktion verwendeten Organismen und ihr Metabolismus in den Fokus. Anwendungen, die von Waschdetergenzien bis hin zu Bio-Pharmazeutika reichen, fordern einerseits niedrige Produktionspreise sowie andererseits hohe Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der post-translationalen Modifikationen. Neben Bakterien und Säugetierzellen sind Hefen sehr gut etablierte Produktionsorganismen. Zu diesen Hefen gehört Pichia pastoris, die immer stärker in der Industrie für rekombinante Proteinproduktion genutzt wird. In dieser Arbeit stehen die Vergrößerung des Wissensraums von P. pastoris sowie die Werkzeuge für die Protein-Produktionspipeline im Fokus. Für die Optimierung von Pichia pastoris wird detailliertes Wissen über das Aminosäure-Netzwerk benötigt. Die Aminosäure Leucin wurde als Paradebeispiel ausgewählt, da ihre Biosynthese aus einem kompartimentierten Multi-Enzym-Stoffwechselweg besteht, der in Saccharomyces cerevisiae (Backhefe) von duplizierten Genen codiert wird. Nichtsdestotrotz gab es bisher keine Informationen über den Stoffwechselweg in anderen Hemiascomyceten. Eine Kombination von bioinformatischen Analysen und Proteinlokalisationsstudien zeigte jedoch, dass Backhefe nicht als generelle Vorlage für jeden Aminosäure-Biosyntheseweg in Hefen verwendet werden kann. Letzt endlich konnte die Struktur des Leucin Biosynthesewegs in P. pastoris bestimmt werden. Mit den zuvor gewonnenen Informationen konnte die Theorie, die Aminosäure-Verfügbarkeit mithilfe der Deregulation des Biosynthese-Stoffwechselwegs zu erhöhen, am Beispiel von Leucin aufgezeigt werden. In vielen Aminosäure-Stoffwechselwegen kommt Feedback-Inhibierung vor. Diese wurde hier durch Mutagenese des alpha-Isopropylmalat-Synthase-Gens (LEU4) mithilfe des nicht verstoffwechselbaren Leucin-Analogons Trifluoroleucin entfernt. Experimente mit 13C-markierter Glukose ermöglichte die Messung der von der Zelle selbst synthetisierten Aminosäuren. In der Tat führte die Mutagenese zu einer erhöhten Leucin-Produktion. Diese Vorgehensweise ermöglicht es, Stämme herzustellen, die maßgeschneidert sind für die Überproduktion bestimmter Aminosäuren. Diese Stämme können dann für die Produktion von rekombinanten Proteinen genutzt werden, die besonders viele dieser Aminosäuren für ihre Produktion benötigen. Bei P. pastoris besteht die Herausforderung darin, nach der Transformation die Stämme zu identifizieren, die besonders viel Protein produzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hefe so modifiziert, dass sie magnetisch wurde. Der Knock-out des Vakuolen-Transporterproteins Ccc1p führt zur Ansammlung von Eisen, sofern Eisencitrat präsent ist. Zwar war es möglich, einzelne Hefen zu bewegen, allerdings war die magnetische Anziehung so schwach, dass keine kürzere Trennzeit als 6 h erreicht werden konnte. Ein verbessertes Design wird diskutiert. Für viele Anwendungen ist die Glykosylierung besonders wichtig. Allerdings ist der Einfluss des Metabolismus auf die Glykosylierung selten quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wurde hier der Glykosylierungkettenlänge in Bezug auf die Anzahl der Glykosylierungstellen gewidmet. Je mehr Glykosylierungsstellen bei dem jeweiligen Protein vorhanden waren, desto kürzer wurden die Glykosylierungketten. Die Ergebnisse legen nahe, dass es eine Limitierung in der Verfügbarkeit von cytosolischer GDP-Mannose und der Glykosyltransferase-Kapazität gibt. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass der Metabolismus nicht nur die Rate der Proteinsynthese beeinflusst, sondern auch die Qualität des Proteins. In dieser Arbeit wurden beide Aspekte im Detail untersucht und so wurde ein Beitrag zum stetig wachsenden Wissensraum von P. pastoris geleistet.

With the ever-increasing demand for proteins, the production host, including its metabolism, moves into focus. Applications as different as additives in washing detergents and biopharmaceuticals demand on the one hand low production prices, and on the other hand high reproducibility and comparability of post-translational modifications, respectively. Next to bacteria and mammalian cells, yeasts are well established. One such yeast is Pichia pastoris, increasingly used in industry for recombinant protein production. In this thesis, contributions for increasing the knowledge space of P. pastoris, as well as tools for the protein production pipeline were in focus. As stated, for optimization, one requires knowledge, here, detailed knowledge on the amino acid biosynthesis network. Specifically, the amino acid leucine was chosen as prime example, as it is a multi-enzyme compartmented pathway, also encoded by duplicate genes in baker´s yeast. However, no information in any other hemiascomycetes was available. A combination of bioinformatics analysis and protein localization studies highlighted that baker´s yeast cannot be used as a general blueprint for every yeast amino acid pathway. Finally, the structure of the leucine biosynthesis pathway in P. pastoris could be determined. With this information in hand, the idea of amino acid availability increase by deregulation of synthesis pathways was exemplified using leucine. Feedback inhibition, prominent in many amino acid pathways, was deleted through mutagenesis of the alpha-isopropylmalate synthase gene (LEU4) by the non-metabolizable leucine analogon trifluoroleucine. Stable isotope experiments with 13C-labelled glucose enabled the measurement of de novo synthesized amino acids. Indeed, the mutagenized leucine pathway resulted in increased leucine biosynthesis. This approach enables the construction of strains that are tailored towards the overproduction of defined amino acids and can then be used for the production of recombinant proteins with a bias towards that amino acid. With P. pastoris, the challenge is to find the hyper protein producer after transformation. Here, the yeast was modified to become magnetic. A knockout of the vacuolar transporter protein Ccc1p leads to accumulation of iron if ferric citrate is present. While it was possible to move single yeast, the magnetic attraction was low, resulting in no shorter separation times as 6 h. An improved design is discussed. For many applications glycosylation is key. However, the metabolic impact on glycosylation is rarely quantified. Here, special attention was given to the glycosylation chain length in regard to the glycosylation site number. The more glycosylation sites were present on the protein variant, the shorter the chains got. The results indicate a limitation in cytosolic GDP-mannose availability and glycosyl transferase capacity. The results indicate that metabolism not only impacts the rate of protein synthesis, but also the quality of the protein of choice. Here, both aspects were investigated in detail, contributing to the ever increasing knowledge base of P. pastoris.

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