Generation of highly productive polyclonal and monoclonal tobacco suspension lines from a heterogeneous transgenic BY-2 culture through flow cytometric sorting

Kirchhoff, Janina; Fischer, Rainer

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-41042

Generation of highly productive polyclonal and monoclonal tobacco suspension lines from a heterogeneous transgenic BY-2 culture through flow cytometric sorting = Generierung von hoch-produzierenden polyklonalen und monoklonalen Tabaksuspensionskulturen aus einer heterogenen transgenen BY-2-Kultur mittels durchflusszytometrischer Zellsortierung

Kirchhoff, Janina (Author)

2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Janina Kirchhoff

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

Umfang105 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-04-30

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-41042
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/82807/files/4104.pdf

Einrichtungen

RWTH Aachen (hsbk000000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Durchflusscytometrie (Genormte SW) ; Optimierung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Durchflusszytometrie (frei) ; Durchflusszytometrische Zellsortierung (FACS) (frei) ; Tabaksuspensionskultur (frei) ; fluorescence-activated cell sorting (FACS) (frei) ; tobacco suspension culture (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In den letzten 20 Jahren haben sich Pflanzensuspensionszellen als alternatives Produktionssystem zur Herstellung von humanen und tierischen Pharmazeutika etabliert. Transgene Tabaksuspensionszellen bieten dabei durch vorteilhaftes Wachstum, sowie kostengünstige und kontrollierbare Kultivierungsbedingungen eine sehr viel versprechende Produktionsplattform. Obwohl eine hohe Produktqualität für viele pflanzenproduzierte rekombinante Proteine bereits publiziert wurde, stellen häufig heterogene und gering produzierende transgene Pflanzensuspensionskulturen einen erheblichen Engpass dar, der die wirtschaftliche Rentabilität sowie die Wettbewerbsfähigkeit gegenüber den etablierten bakteriellen oder tierischen Systemen einschränkt. Derzeit werden verschiedenste Strategien verfolgt, die eine Steigerung der rekombinanten Proteinproduktion in Pflanzensuspensionskulturen erzielen sollen. Neben Bioreaktordesign, Bioprozesskontrolle oder den Medium Komponenten, ist ebenfalls die Optimierung des Wirtssystems selbst von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte unter Verwendung der FACS Technologie eine Fluoreszenz-basierte Sortierung von hochproduktiven BY-2 Zellen aus einer heterogenen Tabaksuspensionskultur durchgeführt werden. Die transgenen BY-2 Zellen produzierten neben dem humanen IgG1 Antikörper M12 das Fluoreszenzprotein DsRed, wobei die kodierenden Sequenzen der rekombinanten Proteine als separate Expressionskassetten auf einer T-DNA liegen. Die FACS Strategie beruhte hierbei auf der Annahme, dass innerhalb einer Zelle die Menge des fluoreszierenden Markerproteins mit dem Akkumulationslevel des M12 Antikörpers korreliert. Initiale Experimente hinsichtlich der Präparation von Protoplasten und der Zusammensetzung des Regenerationsmediums führten zu einer zuverlässigen Regeneration von BY-2 Protoplasten, der Ausbildung von Zellwänden und der effizienten Proliferation der Zellen bei geringen Zelldichten (2 x 102 pro ml). Ausgehend von der heterogenen transgenen Suspensionskultur MTED#18 erzielte die konsequente und repetitive durchflusszytometrische Sortierung von stark DsRed fluoreszierenden Zellpools (je 20 Zellen) polyklonale Kulturen mit erhöhter Produktivität für beide rekombinante Proteine. Im Vergleich zur parentalen MTED#18 Kultur erreichte die bestproduzierende polyklonale Kultur MTED#18psR3C11.5.8 10-fach höhere Akkumulationslevel des M12 Antikörpers, sowie eine vierfach angereicherte und homogenere Verteilung von DsRed fluoreszierenden Zellen. Zur FACS vermittelten Generierung von monoklonalen Linien wurde eine auf „Feeder“ Zellen basierende Methode entwickelt, welche die Proliferation einzelner BY-2 Zellen ermöglicht. Die vorliegende Arbeit beschreibt dabei zum ersten Mal ein einfaches Verfahren zur Regeneration einzelner durchflusszytometrisch separierter Suspensionszellen. Die etablierten monoklonalen Suspensionslinien zeigten neben einer deutlich homogeneren DsRed Produktion eine bis zu 13-fach verbesserte M12 Antikörper Akkumulation. Die besten monoklonalen Suspensionslinien MTED#18msR2C24.3 bzw. MTED#18msR2C21.1 erreichten Akkumulationslevel des M12 Antikörpers von bis zu 182.9 ± 7.8 µg/g Frischgewicht, die über ein Jahr stabil produziert wurden. Die Charakterisierung der poly- und monoklonalen Kulturen bezüglich Wachstum und Antikörperproduktion ergab für die Mehrheit der FACS separierten Kulturen, im Vergleich zur parentalen Kultur, ein langsameres Wachstum sowie eine reduzierte Gesamtbiomasse. Dementsprechend wurde der Zeitpunkt der höchsten M12 Antikörper Produktion mit ca. 30 h Verzögerung erreicht. Die maßstabsvergrößerte Kultivierung der monoklonalen BY-2 Linie MTED#18msR2C21.1 in einem 3 Liter Bioreaktor war erfolgreich und erzielte eine volumetrische M12 Antikörper Akkumulation von 141 ± 3 mg/l. Ein Wert, der die im Schüttelkolben erreichte Produktivität um 50% übertrifft. Mit dem Ziel einer weiteren Steigerung der M12 Akkumulation wurde die Kultivierung verschiedener monoklonaler Suspensionslinien in Stickstoff angereichertem Medium untersucht. Im Vergleich zum Standard BY-2 Medium konnten dadurch die Mengen an rekombinantem M12 Antikörper zwischen 18-100% erhöht werden. Die FACS vermittelte Generierung transgener polyklonalen Linien frühzeitig nach einer Transformation führte zur schnellen Etablierung hoch produktiver transgener Tabakkulturen mit einer Zeitersparnis von 2,5 Monaten. BY-2 Zellen wurden dazu mit Pflanzenexpressionsvektoren transformiert, welche entweder den M12 Antikörper in Kombination mit DsRed oder das fluoreszierende Protein tGFP kodierten. Die transgenen Kulturen wurden simultan durch die FACS Selektion von transgenen Zellen sowie durch die konventionelle Kallus-basierte Strategie etabliert. Vergleichende immunologische Analysen bestätigten, dass die Mehrheit der transgenen Kulturen aus der FACS Selektion eine stärkere Homogenität und 1,6-fach mehr M12 Antikörper bzw. 2,4-fach mehr tGFP besaßen, als die über konventionelle Kallusgenerierung etablierten Kulturen.

Over the last 20 years, plant cells gained increasing interest as host systems for the production of human and animal pharmaceuticals. Transgenic tobacco suspension cultures are an especially promising production host because of their beneficial growth, low maintenance requirement and the possibility of contained cultivation in bioreactors under controlled conditions. The excellent product quality of plant-produced proteins was demonstrated for a multitude of proteins, but the heterogeneous and low protein productivity of transgenic plant suspension cultures is still a bottleneck that constrains their economic profitability and their competitiveness towards established systems like mammalian cells or yeasts. To overcome this current drawback various strategies are followed to boost recombinant protein level in plant suspension cultures. Currently, the optimization of bioreactor design, bioprocess control or medium composition is investigated on a broad range, but also the optimization of the plant host systems themselves are of major interest. The objective of this work was the application of fluorescence activated cell sorting (FACS) technology for the selection of highly productive BY-2 cells from a heterogeneous tobacco suspension culture. The BY-2 cells co-produce the human antibody M12 and the selectable marker protein DsRed; the coding sequences of the recombinant proteins were present as separate expression cassettes on one T-DNA. The FACS strategy was based on the assumption that the amount of the fluorescent marker protein correlates with the amount of antibody produced within a cell. Initial experiments on protoplast preparation and regeneration medium composition led to the reliable regeneration of BY-2 protoplasts, the sustained reformation of cell walls and the efficient proliferation of plant cells at low densities (2 x 102 per ml). Starting from the heterogeneous transgenic BY-2 suspension culture MTED#18 the strict and consecutive flow cytometric sorting of highly DsRed fluorescent cells in pools of 20 cells resulted in the isolation of polyclonal suspension cultures that showed increased levels of both recombinant proteins and the highest producing culture MTED#18psR3C11.5.8 accumulated almost 10-fold more M12 antibody than the parental MTED#18 culture. Similarly, it was demonstrated that flow sorting also resulted in a fourfold enrichment of DsRed fluorescent cells that showed a homogeneous distribution of the red fluorescence. For the FACS-based generation of monoclonal lines a procedure using feeder cells was developed that enabled the regeneration of single BY-2 cells. In fact, this work describes for the first time, a straightforward procedure for single cell regeneration after flow sorting. Monoclonal BY-2 lines with advanced homogeneity and up to finally 13-fold improved recombinant M12 productivity were established. For the best monoclonal lines, i.e. MTED#18msR2C24.3 or MTED#18msR2C21.1, recombinant M12 antibody accumulation levels of up to 182.9 ± 7.8 µg/g fresh weight were obtained that also remained stable over an observation period of one year. The characterization of the improved polyclonal cultures and monoclonal lines regarding growth and M12 antibody production revealed that the growth was delayed and the overall biomass was reduced for the majority of flow sorted suspensions compared to the parental culture. Correspondingly, the time point of highest M12 accumulation was delayed with a retardation time of approx. 30 h. The up-scaled cultivation of the monoclonal BY-2 line MTED#18msR2C21.1 in a 3 l stirred tank bioreactor was successful and a volumetric M12 antibody accumulation of 141 ± 3 mg/l was reached, a value that exceeded the one determined for the same suspension culture grown in shake flasks by 50%. Aiming at a further increase in M12 antibody accumulation the impact of cultivation in nitrogen-enriched medium was investigated for various monoclonal suspension lines. Indeed, the recombinant M12 antibody amounts were 18-100% higher upon cultivation in nitrogen-enriched medium compared to the standard BY-2 medium. The FACS-supported generation of transgenic polyclonal cell lines at an early stage after a transformation resulted in the rapid generation of highly productive transgenic tobacco cultures with a time saving of 2.5 months. BY-2 cells were transformed with plant expression vectors encoding either the M12 antibody in combination with DsRed or the fluorescent protein tGFP. Transgenic cultures were simultaneously established by FACS-based selection of transgenic events and by the conventional callus-based strategy. Comparative immunological analyses confirmed that the majority of transgenic suspension cultures originating from the FACS selection were of superior homogeneity and produced 1.6-fold more M12 antibody or respectively 2.4-fold more tGFP compared to the amounts determined for the cultures derived from the conventional transformation procedure.

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