Engineering of biocatalytic microgels and bifunctional peptides for biohybrid systems

Nöth, Maximilian Wolfgang Stefan; Schwaneberg, Ulrich; Pich, Andrij

doi:10.18154/RWTH-2021-10064

Engineering of biocatalytic microgels and bifunctional peptides for biohybrid systems = Engineering von biokatalytischen Mikrogelen und bifunktionalen Peptiden für biohybride Systeme

Nöth, Maximilian Wolfgang Stefan^RWTH*

2021 & 2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Maximilian Nöth Master of Science Biochemie

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2021

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2022

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Pich, Andrij (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2021-07-02

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-10064
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/834681/files/834681.pdf

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Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymimmobilisierung (frei) ; Klickchemie (frei) ; Materialbindepeptid (frei) ; Materialfunktionalisierung (frei) ; Mikrogel (frei) ; P450 BM3 Monooxygenase (frei) ; P450 BM3 monooxygenase (frei) ; click chemistry (frei) ; enzyme immobilization (frei) ; material binding peptide (frei) ; material functionalization (frei) ; microgel (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Biohybride Materialien und Systeme bieten großes Potenzial für die Biokatalyse und Materialwissenschaften, da die Kombination von biologischen und synthetischen Bausteinen das Design von neuartigen funktionalen biohybriden Katalysator- und Materialkonzepten ermöglicht. Für die Entwicklung neuer biohybrider Materialien und Systeme werden neue Strategien zur Integration von biokatalytischen Funktionalitäten in Materialien und zur Material- und Oberflächenfunktionalisierung benötigt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei neuartige biohybride Systeme für die Biokatalyse sowie die universelle Funktionalisierung von Materialien und Oberflächen entwickelt: Das erste Kapitel befasst sich mit der Immobilisierung der Cytochrom P450 BM3 Monooxygenase in stimuliresponsiven „smarten“ Mikrogelen (P450 μ-Gelzyme), während das zweite Kapitel die Entwicklung eines Werkzeugkastens für die universelle Oberflächenfunktionalisierung von synthetischen Polymeren, Metallen und siliziumbasierten Materialien, auf Basis bifunktionaler Peptide, umfasst. Enzyme sind von der Natur entwickelte Biokatalysatoren die (bio)chemische Reaktionen unter umweltfreundlichen Reaktionsbedingungen mit beeindruckenden Chemo-, Regio- und Stereoselektivitäten durchführen können. P450 Monooxygenasen sind vielseitige Biokatalysatoren, die über ein hohes synthetisches Anwendungspotenzial verfügen, deren Nutzung jedoch, unter anderem, durch ihre geringe Stabilität unter Anwendungsbedingungen erschwert wird (z. B. geringe Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, Inaktivierung nach einer bestimmten Reaktionszeit). Die Enzymimmobilisierung ist eine der erfolgreichsten Strategien, um die Stabilität von Enzymen zu verbessern und ermöglicht darüber hinaus die Freisetzung, die erneute Immobilisierung und das Recycling von Enzymen. P450 Monooxygenasen sind schwierig zu immobilisieren. Im Fall von P450 BM3, aus Bacillus megaterium, ist die Aktivität nach der Immobilisierung oft beeinträchtigt oder geht ganz verloren. Als eine innovative Klasse von Trägermaterialien für die Enzymimmobilisierung haben stimuliresponsive und „smarte“ Mikrogele Aufmerksamkeit erregt, da sie über chemische und mechanische Stabilität, anpassbare Architektur, Biokompatibilität, Porosität und einen hohen Wassergehalt verfügen. Darüber hinaus ermöglichen Mikrogele hohe Enzymbeladungen und bieten eine schützende Umgebung für die immobilisierten Enzyme. Neue Strategien zur Integration von Enzymen in Mikrogelen und neue Mikrogelsysteme müssen entwickelt werden, um das Potenzial von stimuliresponsiven Mikrogelen als Plattform für die Immobilisierung von „sensitiven“, schwierig zu immobilisierenden Enzymen zu nutzen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte P450 BM3 zum ersten Mal ohne Verlust der katalytischen Aktivität und unabhängig vom pH-Wert in einem neuen Typ von Poly(N-Vinylcaprolactam) Mikrogelen, die über 1-Vinyl-3-Methylimidazolium als Comonomer verfügen, immobilisiert werden (biohybride P450 μ-Gelzyme). Darüber hinaus wurden die Leistungsfähigkeit der biohybriden P450 μ-Gelzyme zum ersten Mal systematisch untersucht. Die positive und pH-unabhängige Ladung der Poly(N-Vinylcaprolactam) Mikrogele wurde durch Quaternisierung der 1-Vinylimidazol Comonomere ermöglicht (1-Vinyl-3-Methylimidazolium). Durch die pH-unabhängige Immobilisierung konnten die biohybriden P450 μ-Gelzym Katalysatoren im pH-Aktivitätsoptimum genutzt werden (pH 8). Darüber hinaus ermöglichten die P450 μ-Gelzyme die durch Ionenstärke steuerbare Freisetzung und erneute Immobilisierung von P450 BM3, sowie das Recycling des Biokatalysators und boten erste Schutzwirkungen gegen organische Lösungsmittel. Die biologische Transformation der Materialwissenschaften ebnet durch die Kombination und Integration von biologischen und synthetischen Bausteinen in Materialien (z. B. Biofunktionalisierung von synthetischen Polymeren, Metallen und siliziumbasierten Materialien) den Weg zu neuartigen biohybriden Materialkonzepten. Voraussetzungen für die biologische Transformation der Materialwissenschaften sind universell einsetzbare und spezifische Methoden für die Funktionalisierung von Materialien und Oberflächen. Diese sind stellen aber aufgrund der sehr unterschiedlichen Eigenschaften von Materialien und Oberflächen eine zentrale Herausforderung dar. Um diese Kernherausforderung zu lösen, müssen innovative Technologien für die Material- und Oberflächenfunktionalisierung entwickelt werden. Die biologische Oberflächenfunktionalisierung mit Materialbinde- oder Ankerpeptiden ermöglicht die einfache Ausrüstung von Materialen mit biologischen und synthetischen Funktionalitäten und ist eine energieeffiziente und umweltfreundliche Alternative zu chemischen und physikalischen Oberflächenfunktionalisierungsstrategien. Basierend auf diesem Konzept wurde ein neuartiger Werkzeugkasten für die universelle Material- und Oberflächenfunktionalisierung, basierend auf bifunktionalen Peptiden, entwickelt. Bifunktionale Peptide wurden durch sortasevermittelte Ligation unter Verwendung von Sortase A aus Staphylococcus aureus synthetisiert. Im Detail wurde das universelle Ankerpeptid LCI aus Bacillus subtilis mit verschiedenen Aminfunktionalitäten modifiziert (z. B. reaktive Gruppen für Click-Chemie, Fluoreszenzfarbstoffe, Antibiotika, synthetische Polymere). Die sortasevermittelte Ligation ermöglichte darüber hinaus die Aufreinigung der bifunktionalen Peptide durch eine Negativ-Reinigungsstrategie mittels Strep-tag II-Affinitätschromatographie (Reinheit > 90 %). Der Werkzeugkasten ermöglichte, basierend auf bifunktionalen Peptiden, die Funktionalisierung von Oberflächen entweder durch eine Zwei- oder eine Einschrittstrategie. Im Fall der Einschrittstrategie wurde LCI direkt mit der gewünschten Funktionalität ausgerüstet, während im Fall der Zweischrittstrategie LCI mit einer reaktiven Gruppe modifiziert wurde, die eine weitere Funktionalisierung ermöglichte (z. B. durch Click-Chemie). Bei der Zweischrittstrategie wurden synthetische Polymere (Polypropylen, Polyethylenterephthalat), Metalle (Edelstahl, Gold) und Silizium mit reaktiven Gruppen für die kupferfreie Azid-Alkin Click-Chemie funktionalisiert. Die Anwendbarkeit der Einschrittstrategie wurde durch die direkte Funktionalisierung von Polypropylen mit einem Fluoreszenzfarbstoff und Biotin demonstriert. Insgesamt repräsentieren diese Ergebnisse die erste systematische Kombination von universellen Ankerpeptiden, wie LCI, und sortasevermittelter Ligation in einem universellen Oberflächenfunktionalisierungswerkzeugkasten, einschließlich der ersten peptidvermittelten Funktionalisierung von Polypropylen und Polyethylenterephthalat mit reaktiven Gruppen für die kupferfreie Azid-Alkin Click-Chemie.

Biohybrid materials and systems have great potential in the fields of biocatalysis and materials science, as the combination of biological and synthetic building blocks enables the design of novel biohybrid catalyst and material concepts that convey new functionalities. New strategies for integrating biocatalytic functionalities into materials and for material and surface functionalization are needed, to develop new biohybrid materials and systems. In this thesis, two novel biohybrid systems for biocatalysis and universal material and surface functionalization were developed: in the first chapter, P450 μ-Gelzymes were established by immobilizing cytochrome P450 BM3 monooxygenase in stimuli-responsive "smart" microgels, while in the second chapter, a universal surface functionalization toolbox based on bifunctional peptides was developed for the functionalization of synthetic polymers, metals, and silicon-based materials.Enzymes are biocatalysts evolved by nature to perform (bio)chemical reactions at environmentally benign reaction conditions with impressive chemo-, regio-, and stereoselectivities. P450 monooxygenases are versatile biocatalysts with high synthetic application potential, but their application is yet challenged, amongst others, by their low operational stability (e.g., low organic solvent tolerance, enzyme inactivation after a certain reaction time). Enzyme immobilization is one the most successful strategies to improve enzyme stability and enables the release, re-immobilization, and recycling of enzymes. P450 monooxygenases are challenging to immobilize, and in the case of P450 BM3 from Bacillus megaterium, the activity of the immobilized enzyme is often deteriorated or entirely lost. Microgels have attracted attention as an innovative class of "smart" and stimuli-responsive carriers for enzyme immobilization due to their chemical and mechanical stability, tuneable architecture, biocompatibility, porosity, high water content, and the ability to achieve high enzyme loadings and provide a protective environment for the immobilized enzymes. Therefore, new strategies for integrating enzymes in microgels and new microgel systems need to be developed to harness the potential of stimuli-responsive microgels as a carrier platform for "sensitive" enzymes that are challenging to immobilize. This work reports the first pH-independent immobilization of P450 BM3 in novel poly(N-vinylcaprolactam) microgels with 1-vinyl-3-methylimidazolium as comonomer without loss of catalytic activity (biohybrid P450 μ-Gelzymes) and the first systematic study of P450 μ-Gelzyme performance. Poly(N-vinylcaprolactam) microgels were synthesized with a pH-independent, positive charge by modifying 1-vinylimidazole moieties through a quaternization reaction (1-vinyl-3-methylimidazolium). The pH-independent immobilization allowed to operate biohybrid P450 μ-Gelzyme catalysts at the pH activity optimum (pH 8). In addition, P450 μ-Gelzymes enabled ionic-strength triggered release and re-immobilization of P450 BM3 as well as biocatalyst recycling for repeated use and provided initial protective effects against organic cosolvents.The biological transformation of materials science is paving the way to novel biohybrid material concepts by combining and integrating biological and synthetic building blocks in materials (e.g., biofunctionalization of synthetic polymers, metals, and silicon-based materials). Universally applicable and specific material and surface functionalization methodologies are prerequisites for the biological transformation of materials science but pose a key challenge due to the vastly different properties and chemistries of materials and surfaces. Innovative material and surface functionalization technologies have to be developed to address this challenge. Biological surface functionalization with material binding or anchor peptides is a simple strategy to endow materials with biological and synthetic functionalities and an energy-efficient and environmentally benign alternative to chemical and physical surface functionalization strategies. Following this notion, a novel toolbox concept for universal material and surface functionalization based on bifunctional peptides was developed. Bifunctional peptides were synthesized by specific modification of the universal anchor peptide LCI from Bacillus subtilis with different functional amine moieties (e.g., reactive groups for click chemistry, fluorescent dyes, antibiotics, synthetic polymers) through sortase-mediated ligation employing sortase A from Staphylococcus aureus. Sortase-mediated ligation further enabled the purification of bifunctional peptides by a negative purification strategy using Strep‐tag II affinity chromatography (purities > 90%). In general, the bifunctional peptide toolbox enabled surface functionalization either as a two or one-step strategy. In the case of the one-step strategy, the desired functionality was directly introduced to LCI, while in the case of the two-step strategy, LCI was modified with a reactive group that enabled further functionalization (e.g., employing click chemistry). For the two-step strategy, synthetic polymers (polypropylene, polyethylene terephthalate), metals (stainless steel, gold), and silicon were functionalized with reactive groups for copper-free azide-alkyne click chemistry. The one-step strategy was demonstrated by direct functionalization of polypropylene with a fluorescent dye and biotin. These results represent the first systematic combination of universal anchor peptides, like LCI, and sortase-mediated ligation in a toolbox concept for universal surface functionalization, including the first peptide-mediated functionalization of polypropylene and polyethylene terephthalate with reactive groups for copper-free azide-alkyne click chemistry.

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