Filamentous co-cultivation for the conversion of cellulose into pigmented antibiotics

Finger, Maurice; Büchs, Jochen; Agler-Rosenbaum, Miriam

doi:42410

Filamentous co-cultivation for the conversion of cellulose into pigmented antibiotics = Filamentöse Ko-Kultivierung für die Umwandlung von Zellulose in Pigmentierte Antibiotika

Finger, Maurice^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Maurice Finger

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-07-11

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-07006
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/961737/files/961737.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Projekte

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
cellulose hydrolysis (frei) ; respiration activity (frei) ; solid medium cultivations (frei) ; streptomyces coelicolor (frei) ; substrate affinity (frei) ; trichoderma reesei (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Der Bedarf an Naturprodukten wie Antibiotika ist größer denn je. Angetrieben durch aufkommende Antibiotikaresistenzen sind neue Produktionsverfahren von besonderem Interesse. Insbesondere filamentöse Ko-Kulturen bieten ein großes Potenzial für die Entdeckung neuer Naturprodukte oder die Intensivierung von Prozessen. Diesen Vorteilen steht jedoch eine im Vergleich zu axenischen Kulturen erhöhte Komplexität gegenüber, die die Nutzung von Ko-Kulturen aufgrund des fehlenden Prozessverständnisses erschwert.In dieser Arbeit wurde ein filamentöser Ko-Kultivierungsprozess mit dem zellulolytischen Pilz Trichoderma reesei RUT-C30 und dem Bodenbakterium Streptomyces coelicolor A3(2) für die Produktion von Naturprodukten entwickelt. Durch die Bereitstellung von Zellulose als primäre Kohlenstoffquelle wurde eine Abhängigkeit zwischen den Ko-Kultivierungspartnern geschaffen. Die Zellulose kann durch Zellulasen unter Freisetzung von löslichen Zuckern hydrolysiert werden. Zellulasen werden nur von T. reesei gebildet und sekretiert. Die Komplexität dieses Systems wurde durch den Einsatz von Online-Messtechnik mit hohem Durchsatz reduziert. Die Biomassebildung der Ko-Kultivierungspartner wurde individuell durch die Überwachung des Fluoreszenzproteins mNeonGreen in S. coelicolor und mCherry in T. reesei mit einem 48-Well-Mikrotiterplatten-System verfolgt. In Kombination mit den Informationen über die Sauerstofftransferraten wurde hieraus der Einfluss des Inokulationsverhältnisses, der Osmolalität und des spezifischen Leistungseintrags auf die Populationszusammensetzung erfolgreich abgeleitet. Die Ko-Kultivierung wurde von der Mikrotiterplatte in einen Rührkesselreaktor hochskaliert. Im Rührkesselreaktor wurde mit der Ko-Kultivierung auf Zellulosesubstrat ein mehr als 2-fach erhöhter Titer des pigmentierten Antibiotikums Actinorhodin im Vergleich zu Glukose-limitierten axenischen S. coelicolor Kulturen erreicht.Da die Substrataffinität ein kritischer Parameter in Kohlenstoff-limitierten Ko-Kulturen ist, wurde eine neue respiratorische Methode für die Abschätzung der Affinität entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um die Affinität von Corynebacterium glutamicum und T. reesei für Glukose sowie die Affinität eines genetisch veränderten Gluconobacter oxydans für Fruktose zu bestimmen. Das Potenzial der Atmungsüberwachung wurde auch für Agar-Kulturen demonstriert. Anstelle einer visuellen Untersuchung wird ein objektiver Atmungsparameter für die Bewertung von Kultivierungen auf festen Medien verwendet. Die Methode wurde erfolgreich für diverse Anwendungen auf Agar demonstriert.Die vorgestellte Arbeit liefert wertvolle Erkenntnisse und Werkzeuge für die Entwicklung definierter filamentöser Ko-Kulturen, die bei der Herstellung neuartiger Naturprodukte helfen.

The demand for novel natural products such as antibiotics is greater than ever. Driven by emerging antibiotic resistances, new production processes are of particular interest. Especially filamentous co-cultivations offer vast potential for the discovery of novel natural products or process intensification. However, these benefits go hand in hand with an inherently increased complexity compared to axenic cultivations, impeding utilization due to the lack of process understanding. This thesis focused on establishing a model filamentous co-cultivation process with the cellulolytic fungus Trichoderma reesei RUT-C30 and the soil bacterium Streptomyces coelicolor A3(2) for the production of natural products. By providing cellulose as the primary carbon source, a dependency was created between the co-cultivation partners. The cellulose was hydrolysed by cellulases, releasing soluble sugars. Cellulases were only formed and secreted by T. reesei. The complexity of this system was reduced by the utilization of high-throughput online monitoring systems. Biomass formation of the co-cultivation partners was individually tracked by monitoring the fluorescence protein mNeonGreen in S. coelicolor and mCherry in T. reesei with an in-house built 48 well microtiter plate-based system. In combination with the information on the oxygen transfer rates, the influence of the inoculation ratio, the osmolality and the specific power input on the population composition were successfully derived. The co-cultivation was transferred from the microtiter plate into a stirred tank reactor. In the stirred tank reactor, a more than 2-fold increased titer for the pigmented antibiotic actinorhodin was achieved compared to glucose-limited axenic S. coelicolor cultivations. As substrate affinity is a critical parameter in carbon source limited co-cultivations, a novel respiratory method was developed for the fast initial estimation. The method was utilized to estimate the glucose affinity of Corynebacterium glutamicum and T. reesei as well as the fructose affinity of a genetically modified Gluconobacter oxydans. The potential of respiration monitoring was further demonstrated for agar cultivations. Instead of a visual examination, the respiration represents an objective parameter for evaluating cultivations on solid media. The method was successfully demonstrated for several agar-based applications. The presented work provides valuable insights and tools for the development of defined filamentous co-cultivations, which assist in the production of novel natural product.

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