Exploring the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha as a production platform for valuable chemicals from C1 compounds

Wefelmeier, Katrin; Büchs, Jochen; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2024-07371

Exploring the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha as a production platform for valuable chemicals from C1 compounds

Wefelmeier, Katrin^RWTH*

2024

VerantwortlichkeitsangabeKatrin Wefelmeier

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

ISBN398555224X, 978-3-98555-224-5

ReiheApplied microbiology ; 35

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Druckausgabe: 2024. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-03-11

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-07371
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/990508/files/990508.pdf

Einrichtungen

Projekte

BMBF 031B0850A - Mikrobielle Biofabriken: METAFOR - Entwicklung eines Ogataea polymorpha Plattformstamms für die Umsetzung von C1-Verbindungen in Wertprodukte (Teilprojekt A) (BMBF-031B0850A) (BMBF-031B0850A)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
C1 molecules (frei) ; Ogataea polymorpha (frei) ; bioeconomy (frei) ; metabolic engineering (frei) ; methanol (frei) ; methylotrophic yeast (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Frage, wie wir eine nachhaltige Gesellschaft aufbauen können, die die planetaren Grenzen respektiert und künftigen Generationen eine Lebensgrundlage bietet, ist eine der dringendsten Herausforderungen der Menschheit. Eine zirkuläre Bioökonomie, die sich auf Mikroorganismen zur Herstellung industriell relevanter Produkte stützt, könnte ein vielversprechender Weg in die Zukunft sein. Die Etablierung einer Bioökonomie sollte jedoch weder den Druck auf Ökosysteme erhöhen noch mit der Lebensmittelindustrie konkurrieren. Ein-Kohlenstoff-Moleküle (C1-Moleküle) sind daher vielversprechende mikrobielle Substrate, da sie aus $CO_2$ und grünem Wasserstoff gewonnen werden können und ihre Produktion somit keine zusätzlichen landwirtschaftlichen Flächen erfordert. Unter den C1-Molekülen stellen Methanol und Formiat eine attraktive Gruppe dar, da sie mit Wasser mischbar sind und so leicht in herkömmlichen Fermentationsprozessen ergänzt werden können. In dieser Arbeit wird daher das Potenzial der methylotrophen Hefe $Ogataea$ $polymorpha$ als Chassisorganismus für die Umwandlung von Methanol und Formiat in industriell relevante Produkte untersucht. Als nicht-konventionelle Hefe steht für $O.$ $polymorpha$ nicht die Vielfalt an genetischen Werkzeugen zur Verfügung, die für Modellmikroorganismen existiert. Daher wurde der genetische Werkzeugkasten für $O.$ $polymorpha$ um eine Reihe von gut charakterisierten Promotoren und Terminatoren erweitert, die für methanolbasierte Kultivierungen verwendet werden können. Diese genetischen Elemente wurden anschließend verwendet, um eine Reihe verschiedener Produkte aus Methanol herzustellen. Laktat wurde als erstes potenzielles Produkt ausgewählt, um die Machbarkeit der Herstellung von niedermolekularen Substanzen aus Methanol durch $O.$ $polymorpha$ zu bewerten. Durch Stammentwicklung und adaptive Laborevolution wurde ein Stamm konstruiert, der Laktat im g/L-Maßstab produziert und eine erhöhte Wachstumsrate auf Methanol aufweist. Dabei wurde die Methanoltoxizität als eine Hauptherausforderung für die Kultivierung von $O.$ $polymorpha$ im Labormaßstab identifiziert. Für $O.$ $polymorpha$ Stämme, welche für die Produktion von Malat konstruiert wurden, wurden deshalb Strategien zur Methanolfütterung weiter verfeinert, indem ein automatisches Methanolzufuhrsystem für Schüttelkolben angewandt wurde. Zudem wurde der Malatexport durch die Plasmamembran als kritischer Faktor identifiziert, der die Malatproduktion aus Methanol in $O.$ $polymorpha$ beeinflusst. Um die Vielfalt an Molekülen zu demonstrieren, die mit Methanol als Kohlenstoffquelle hergestellt werden könnten, wurde die Hefe weiter modifiziert, um Aceton und Isopren zu produzieren. Zuletzt wurde Formiat als potenzielles neues C1-Substrat für $O.$ $polymorpha$ erforscht. Der native C1-Stoffwechsel von $O.$ $polymorpha$ wurde genauer charakterisiert und Formiat-assimilierende Enzyme wurden in die Peroxisomen der Hefe eingebracht. Obwohl das Wachstum auf Formiat als alleiniger Kohlenstoffquelle nicht nachgewiesen werden konnte, wurde gezeigt, dass die Zufuhr geringer Konzentrationen an Formiat als Co-Substrat einen positiven Effekt auf die Biomassebildung haben kann, was wahrscheinlich zurückzuführen ist auf die zusätzlichen Elektronen, die die Oxidation von Formiat zu $CO_2$ für den zellulären Stoffwechsel bereitstellen kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern daher eine wertvolle Wissensgrundlage für die künftige Entwicklung methylotropher Hefestämme, die zur Etablierung einer zirkulären Bioökonomie auf der Basis von C1-Molekülen beitragen könnten.

The question of how we can build a sustainable society that respects planetary boundaries and provides a livelihood for future generations is one of the most pressing challenges facing humanity. It is clear that the linear produce-use-waste society, which is largely dependent on fossil resources, cannot persist. Therefore, alternative solutions for a more sustainable production of industrially relevant products are urgently needed. A circular bioeconomy that relies on microorganisms to produce industrially relevant products has been proposed as a promising way forward. However, the establishment of a bioeconomy is only desirable if it is based on raw materials that do not increase the pressure on ecosystems or compete with the food industry. One carbon (C1) molecules are particularly promising microbial substrates, as they can be derived from $CO_2$ and green hydrogen and therefore have the potential to be sustainable feedstocks that do not require the use of additional arable land. Among the C1 molecules, methanol and formate represent an attractive substrate group, as they are miscible with water and can therefore be easily supplemented in conventional fermentation processes. This work investigates the potential of the native methylotrophic yeast $Ogataea$ $polymorpha$ as a chassis organism for the conversion of methanol and formate into industrially relevant products. Since $O.$ $polymorpha$ is a non-conventional yeast, the diversity of genetic tools that is available for standard model microorganisms does not yet exist. Therefore, this work extended the genetic toolbox for $O.$ $polymorpha$ by a set of well-characterized promoters and terminators that can be used for methanol-based cultivation approaches. These genetic elements were used to engineer the yeast to produce a range of different products from methanol. Lactate was selected as the first potential product to assess the feasibility of producing low molecular weight biochemicals from methanol. Through strain engineering and adaptive laboratory evolution, an $O.$ $polymorpha$ strain was obtained that produced lactate at g/L scale and showed an increased growth rate on methanol. Methanol toxicity was identified to be a major obstacle to the cultivation of $O.$ $polymorpha$ at laboratory scale. As a result, methanol feeding strategies for strains engineered to produce malate from methanol were further refined through the use of an automated methanol feeding system for shake flasks. Further, the malate export across the plasma membrane was identified as a key variable impacting malate production from methanol in $O.$ $polymorpha$. To investigate the variety of chemicals that may be produced by $O.$ $polymorpha$ using methanol as a carbon source, the yeast was further modified to produce acetone and isoprene as additional proof of concept molecules. Lastly, the use of formate as a novel C1 substrate for $O.$ $polymorpha$ was explored. The native C1 metabolism of $O.$ $polymorpha$ was characterized in more detail and formate-assimilating enzymes were introduced into the peroxisomes of the yeast. Although growth with formate as the sole carbon source could not be demonstrated, it was shown that the supply of low concentrations of formate as a co-substrate can have a positive effect on biomass formation, likely due to the additional electrons that the oxidation of formate to $CO_2$ can provide for cellular metabolism. These findings therefore provide a valuable knowledge base for the future development of methylotrophic yeast strains that could contribute to a circular bioeconomy based on C1 molecules.

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